巨藻Lessonia nigrescens巖藻多糖對煙草幼苗低溫脅迫的緩解效應

鄒平，楊霞，云龍，龔鵬飛，丁朋輝，周家新，杜秀春，楊偉，徐海波，李義強，曹亞凡

(1.中國農業科學院煙草研究所，山東 青島 266101；2.陜西省煙草公司延安市公司，陜西 延安 716000；3.華環國際煙草有限公司，安徽 滁州 233121；4.山東青島煙草有限公司，山東 青島 266000；5.上海煙草集團有限責任公司，上海 200082)

生物刺激素能夠促進植物營養吸收、提高植物抗逆性及抗病性，提高作物品質，可有效緩解植物逆境脅迫損害[1]?？紤]到作物遭受極端溫度、干旱和土壤鹽漬化影響的普遍性，生物刺激素在農業生產中對作物產量與品質的貢獻和作用越來越大。目前，植物生物刺激素主要包含海藻提取物、腐植酸、蛋白水解物與氨基酸、殼聚糖及其衍生物和微生物菌劑等種類[2]。其中，海藻提取物是一類重要的生物刺激素。巖藻聚糖是來源于褐藻的水溶性多糖，是一類結構復雜的海洋硫酸多糖，主要由巖藻糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成，另外含有較低比例的木糖、葡萄糖和氨基葡萄糖等，并具有獨特的硫酸化L－巖藻糖結構[3]。不同褐藻來源巖藻聚糖的單糖組成不同，其巖藻糖含量從20%到90%不等，硫酸根含量差別也較大，從10%到40%不等[4]。巖藻聚糖因其獨特的結構特征而具有多種生理活性，目前多用于醫藥和食品行業。近年來，巖藻聚糖在農業上的應用也越來越受到重視，如在果實保鮮方面，巖藻聚糖能夠通過抑制酪氨酸酶來抑制鮮果褐變[5－7]。有研究提取了兩種不同褐藻的巖藻聚糖，發現它們能夠通過提高苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性以及增加酚類物質含量來增強椰棗的抗病性[8]。本實驗室前期研究發現，巖藻多糖能夠增強小麥耐鹽性[9]。

在煙草生產過程中，尤其是育苗期及移栽后，經常會遭受“倒春寒”帶來的低溫冷害，導致煙苗生長緩慢，葉片黃化，移栽后不能快發，還可導致早花現象，影響煙葉生產。低溫脅迫影響煙草幼苗光合作用和生理代謝，導致植株萎蔫甚至死亡。溫度還能影響煙草中的結構與非結構性碳水化合物含量，從而影響煙葉品質[10]。因此，提高煙草幼苗對低溫脅迫的抗性是煙草生產中急需解決的問題。已有研究報道，外源褪黑素[11]、水楊酸[12]、甜菜堿[13]均能夠提高植株抗氧化酶活性，緩解低溫造成的氧化損傷。本試驗針對煙草幼苗易受冷害影響的實際問題，研究4℃低溫脅迫條件下不同濃度巖藻多糖處理對煙草幼苗的影響，以期為煙草苗期種植和管理提供理論依據，同時細化和推進海藻提取物的農業應用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為雪茄煙H382，屬于低溫敏感品種，由中國農業科學院煙草研究所提供。本實驗室從巨藻Lessonia nigrescens中提取純化得到巖藻多糖(LNP)，其分子量為45.4 kDa，單糖組成及比例為甘露糖0.24、葡萄糖醛酸0.22、巖藻糖0.21、半乳糖0.13、木糖0.13、葡萄糖0.05，硫酸根含量36.3%[9]。

1.2 試驗設計及方法

試驗設5個處理，分別為對照(CK):煙苗25℃培養箱正常培養；低溫處理(CS):煙苗4℃培養箱培養；CS＋T1、CS＋T2、CS＋T3處理:煙苗分別噴施100、500、1 000 mg/L LNP溶液24 h后，置于4℃培養箱培養。3個重復，每重復10盆。

播種育苗前將煙草種子用次氯酸鈉溶液消毒并沖洗干凈。待煙苗長到4葉時，挑選生長良好且一致的幼苗進行移栽，置于光照培養箱中培養。光照培養箱條件為:光照周期14/10 h(晝/夜)，溫度25/20℃(晝/夜)，光照強度800 μmol/(m·s)，相對濕度(65±5)%。待幼苗長出第6片葉時，按試驗設計分組處理，并分別于處理后24、48、72 h進行取樣。將樣葉用液氮速凍，于－80℃條件下保存備用。

1.3 測定指標及方法

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 19.0軟件的Duncan’s多重比較法對數據進行分析，采用OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 LNP對低溫脅迫下煙草幼苗葉片產生速率和H2O2含量的影響

由圖1A看出，低溫脅迫24 h后，煙草幼苗葉片中H2O2快速積累，低溫脅迫處理組是對照組的2.05倍；隨著時間推移，低溫脅迫48 h和72 h后，低溫脅迫組H2O2含量分別是對照組的2.58倍和2.53倍。噴施不同濃度的LNP溶液能夠顯著降低煙草幼苗葉片中H2O2含量。低溫脅迫24 h，100、500、1 000 mg/L LNP處理組H2O2含量較低溫脅迫組分別下降7.0%、13.4%和12.8%；低溫脅迫48 h和72 h，不同濃度LNP處理組H2O2含量較低溫脅迫組分別下降15.7%、28.8%、29.2%和11.1%、32.6%、31.5%。

圖1 不同濃度LNP處理對低溫脅迫下煙草幼苗葉片H2O2含量和產生速率的影響

可見，不同濃度LNP均能夠減少低溫脅迫導致的煙草幼苗體內活性氧積累，從而減輕對植株的氧化損傷。但500 mg/L和1 000 mg/L LNP處理組之間無顯著差異。

2.2 LNP對低溫脅迫下煙草幼苗MDA和脯氨酸含量的影響

由圖2A可見，低溫脅迫處理后，煙苗葉片的MDA含量顯著增加，低溫處理24、48、72 h，MDA含量分別是對照組的1.47、1.63、1.67倍。噴施不同濃度LNP后，煙草葉片MDA含量明顯減少，低溫處理24 h后，100、500、1 000 mg/L LNP處理組MDA含量較低溫脅迫組分別下降12.4%、25.7%、24.9%；低溫處理48 h和72 h，不同濃度LNP處理組MDA含量較低溫脅迫組分別下降11.1%、33.0%、31.8%和13.0%、34.1%、34.5%。表明LNP能夠顯著緩解低溫脅迫對煙草幼苗質膜的氧化損傷，且噴施500 mg/L LNP效果最好。

由圖2B可見，低溫處理24、48、72 h，脯氨酸含量分別比對照組高36.9%、84.8%、48.2%。不同濃度LNP處理可以明顯促進煙草葉片脯氨酸的積累。低溫處理24 h，100、500、1 000 mg/L LNP處理組脯氨酸含量較低溫處理組分別增加10.5%、23.7%、21.9%；低溫處理48 h和72 h，分別增加2.4%、22.5%、35.3%和3.6%、35.3%、33.3%，其中，100 mg/L LNP處理組與低溫脅迫處理的煙苗脯氨酸含量無顯著差異；1 000 mg/L LNP處理組脯氨酸含量略低于500 mg/L LNP處理組，但二者無顯著差異。

圖2 不同濃度LNP處理對低溫脅迫下煙草幼苗葉片MDA和脯氨酸含量的影響

2.3 LNP對低溫脅迫下煙草幼苗葉片滲透調節物質的影響

在逆境脅迫下，植物通過積累滲透調節物質如可溶性糖及和可溶性蛋白來降低細胞滲透勢，維持細胞內水分平衡。由圖3可見，低溫處理24、48 h，煙草葉片可溶性糖含量均是對照組的1.13倍；低溫處理72 h，其含量略低于對照組，但無顯著性差異。不同濃度LNP處理后煙草葉片可溶性糖含量明顯增加。低溫處理24 h，100、500、1 000 mg/L LNP處理組可溶性糖含量較低溫處理組分別增加2.7%、18.6%、17.8%；低溫處理48 h和72 h，分別增加5.8%、17.9%、20.0%和15.9%、48.0%、47.6%。

圖3 不同濃度LNP處理對低溫脅迫下煙草幼苗葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

低溫脅迫下，煙草葉片可溶性蛋白含量與可溶性糖含量具有相似的變化趨勢，均隨處理時間的延長先升高后降低。不同濃度LNP處理均提高了煙草幼苗體內可溶性蛋白含量，且500、1 000mg/L LNP處理組顯著高于100 mg/L LNP處理組。

2.4 LNP對低溫脅迫下煙草幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖4看出，低溫脅迫24、48 h，煙苗葉片SOD活性分別是對照組的1.30、1.26倍，POD活性分別是對照組的1.13、1.26倍，CAT活性分別是對照組的1.45、1.53倍，APX活性分別是對照組的1.24、1.33倍。低溫脅迫72 h，SOD、POD、CAT及APX活性均有一定程度的降低，其中SOD活性顯著低于對照組，而POD、CAT及APX活性與對照組無顯著性差異。噴施不同濃度LNP可以明顯增強煙葉SOD、POD、CAT及APX活性。低溫脅迫24 h，與低溫處理組相比，100、500、1 000 mg/L LNP處理組SOD活性分別提高29.8%、35.5%、34.5%，POD活性分別提高10.7%、29.9%、22.9%，CAT活性分別提高7.8%、14.6%、15.2%，APX活性分別提高26.0%、50.4%、46.8%。低溫脅迫48 h和72 h，與低溫處理組相比，不同濃度LNP處理組的SOD活性分別提高14.3%、38.3%、35.6%和22.3%、72.6%、74.9%，POD活性分別提高6.6%、40.4%、31.5%和35.3%、81.2%、80.9%，CAT活性分別提高4.3%、19.6%、20.0%和52.7%、104.2%、105.6%，APX活性分別提高12.5%、32.5%、33.8%和26.8%、50.3%、47.2%。綜上說明，LNP處理能夠增強煙苗葉片抗氧化酶活力，從而降低低溫對植株的氧化損害。

圖4 不同濃度LNP處理對低溫脅迫下煙草幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

3 討論與結論

低溫脅迫能夠促進植物體內活性氧(ROS)的產生，導致膜脂過氧化，并能夠導致水分失衡，從而影響植物新陳代謝，致使植物萎蔫甚至死亡。植物通過調節滲透平衡和增強體內抗氧化酶活性來抵抗低溫脅迫的不利影響。海藻及其廢棄物產量巨大，在傳統農業中，簡單工藝發酵的海藻提取物一直被當作有機肥料使用；而近年來的研究發現，海藻提取物還能夠發揮生物刺激素的功效，提高植物的抗逆性[15]。研究發現，來源于泡葉藻Ascophyllum nodosum的海藻提取物能夠增強作物對營養物質的吸收，促進作物生長[16，17]，提高農產品的質量[18]，且能夠提高植物抵抗干旱[19]、高溫[20]等逆境脅迫的能力。

但海藻提取物成分復雜，無法確認其發揮作用的活性物質。目前，針對海藻提取物的研發更傾向于從混合物向單一物質發展，其中，利用海藻中豐富的海藻多糖資源制備生物刺激素具有良好的應用前景。褐藻酸主要存在于褐藻細胞壁中，是由甘露糖醛酸(M)和古羅糖醛酸(G)經過1，4－鍵合形成的線型多糖。但褐藻酸分子量大，難溶于水，在農業應用中，需要通過酶降解或者化學降解將其降解成低聚糖，利于植物吸收利用。如研究發現酶解低聚褐藻酸能夠通過激活SA途徑和積累具有抗病原活性的次生代謝物來增強植物的防御反應[21]。低聚海藻酸鹽能夠通過調節細胞滲透勢、提高抗氧化活性等提高植物對干旱脅迫[22]、鹽脅迫[23]等逆境脅迫的耐受性。

當植株受到低溫等逆境脅迫時，植物細胞膜透性增大，結構穩定性下降，膜功能受到影響，最終引起細胞代謝障礙[24]。低溫脅迫下植物可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加，是植物對低溫脅迫的一種應激反應，另外，脯氨酸也可以進行滲透調節并穩定細胞膜結構[25]。對低溫脅迫下的煙草進行轉錄組和代謝組研究表明，低溫處理后煙草氮代謝和糖代謝能力增加，細胞內游離氨基酸及可溶性糖積累，維持了細胞滲透勢，增強了煙草抗低溫能力[26]。本研究中，短時間(24、48 h)低溫脅迫下，煙草體內滲透調節物質明顯增多，這是植株對于低溫脅迫的應激反應；當低溫脅迫72 h后，其含量下降，這是由于低溫阻礙了滲透調節物質合成與代謝。LNP處理后，煙草體內滲透調節物質含量明顯升高，有助于降低細胞滲透勢，維持水分平衡，從而減少了低溫對植株的傷害。研究發現，褐藻寡糖[27]、水楊酸[12]等均能夠增加低溫處理后煙苗植株中脯氨酸積累，減少低溫導致的滲透脅迫，增強煙苗抗低溫能力。

正常生理條件下，ROS積累是植物代謝的必然結果，但在非生物脅迫下過度的ROS積累導致氧化損傷，抑制關鍵代謝酶，誘導細胞死亡。受到脅迫的植物維持活性氧的動態平衡依賴于抗氧化酶系統。本研究中，4℃低溫處理后，煙草植株中產生速率、H2O2含量以及MDA含量均明顯增加，是由于細胞膜遭受低溫導致的氧化傷害。低溫處理24 h及48 h，煙草幼苗體內的SOD、POD和CAT活性均顯著提高；低溫處理72 h，各酶活均明顯下降，低于對照組。研究證明在非生物脅迫下，小麥植株通過增強SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶活性來減輕氧化損傷[28]。不同研究中抗氧化酶的響應趨勢不同，可能是由于抗氧化酶在低溫處理的不同時間段呈現動態變化。短時間低溫脅迫下，如本研究的48 h內，低溫激發了植物自身的免疫反應，誘導植物提高自身抗氧化酶活性來抵御低溫脅迫。在低溫處理時間較長的研究中[12，29]，植株體內酶活力下降，阻礙了正常生理代謝。另外，除了低溫處理的時間、溫度不同，不同的植物種類響應低溫的方式和路徑也可能不同。施用LNP后，煙草幼苗體內產生速率、H2O2含量以及MDA含量均顯著下降，抗氧化酶活性均顯著高于低溫脅迫組；雖然處理72 h亦有所下降，但仍顯著高于低溫脅迫組。說明施用外源LNP可以提高煙苗抗氧化酶活性，增強對活性氧的清除能力，降低低溫對植株的傷害。

海藻多糖濃度對作物的影響不同，Liu等[30]發現蜈蚣藻Grateloupia filicina多糖濃度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)對水稻幼苗的發芽參數有顯著影響，0.1 mg/mL蜈蚣藻多糖顯著提高了水稻幼苗的根長和活力指數。檸條Caragana korshinskii種子萌發參數與藍藻多糖濃度相關，發芽率最高的多糖濃度為60 mg/L，而活力指數最高的多糖濃度為10 mg/L[31]。以上兩項研究中，多糖的種類、類型、濃度均不同，但都表明低濃度多糖能夠提高植物種子活力。本研究中，低濃度100 mg/L LNP對低溫脅迫煙苗緩解作用不大，500、1 000 mg/L LNP能夠顯著提高煙苗抗低溫能力，但二者之間無顯著性差異。這些最佳濃度之間的差異可能是由于多糖的來源不同、植物品種和所處生長階段不同造成的。

總之，噴施巖藻多糖能夠增強低溫脅迫下煙苗抗氧化活性，降低氧化傷害，提高植株體內滲透調節能力，提高植株耐低溫能力。本研究中，500、1 000 mg/L LNP能夠顯著提高煙苗抗低溫能力，考慮到成本及效果，500 mg/L LNP是最優選擇。為了加強海藻多糖類生物刺激素在農業中的應用，其提高植物耐低溫能力的分子機制及對不同品種的普適性還有待進一步研究。