大麗輪枝孢激活蛋白（VdAL）對馬鈴薯晚疫病發生的影響

王興國，劉 霞，張 哲，黃 勛，鄧琳梅，許改換，蔣 杰，楊艷麗*

（1.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省植物病理重點實驗室，云南 昆明 650201）

由致病疫霉［Phytophthora infestans(Mont.)de Bary］引起的馬鈴薯晚疫?。?］，曾在歐洲引發“愛爾蘭大饑荒”，造成重大經濟損失［2］。迄今為止，馬鈴薯晚疫病仍是一種全球范圍內的毀滅性病害，我國馬鈴薯種植區均不同程度地受到晚疫病的危害，一般嚴重時減產10%~20%，特別嚴重時減產50%~70%，甚至絕收［3］。目前，馬鈴薯晚疫病仍以化學防治為主，而化學防治不僅會造成農藥殘留和環境污染，同時還會出現病原菌抗藥性的問題［4］。因此探索晚疫病菌侵染和危害的綠色防控技術尤為重要。

植物激活蛋白是從真菌或細菌中提取獲得的一種植物刺激劑，具有促進植株生長、提高作物產量、改善作物品質以及激發植物對病蟲害的抗性等作用，是一種環境友好型生物農藥［5］。植物激活蛋白對番茄灰霉?。?］、煙草花葉?。?］、白術根腐?。?］等植物病害均具有良好的防治效果。大麗輪枝孢激活蛋白(Verticillium dahliae Asp-f2 Like，VdAL)是源于棉花黃萎菌的一種新型植物激活蛋白，通過葉面噴施后可調節植物激素的信號傳導途徑，通過調節植物鈣調蛋白（CaM）、脂氧合酶2（LOX2）等［9］來激活植物的免疫機制從而提升植物的抗性。VdAL也具有促進植株生長、提高作物產量、改善作物品質、誘導植物產生抗病性等作用，研究表明，VdAL在馬鈴薯［10］、花椰菜［11］、水稻［12］、小麥［13］、青梗菜［14］、花生［15］和葡萄［16］上均表現出良好的促生作用，可增強草莓對白粉?。?］、楊梅［17］對肉蔥病的抗性。但VdAL對晚疫病菌的生物學特性是否有影響以及能否提高馬鈴薯植株對晚疫病的抗性等尚不明確。

鑒于此，本研究通過試驗探究了VdAL對晚疫病菌生物學特性的影響，分析了經過處理后的馬鈴薯植株中的苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）等的活性變化，以及丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、可溶性蛋白（Soluble protein，SP）等與抗性相關物質的含量變化以及與馬鈴薯晚疫病發生的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試馬鈴薯品種及菌株 供試品種為青薯9號，供試菌株為ZT10，均由云南農業大學馬鈴薯病害研究室提供。

1.1.2 供試培養基 黑麥番茄培養基：黑麥75 g，瓊脂15 g，番茄汁100 mL，碳酸鈣1.0 g，蒸餾水850 mL，pH值6.5~7.0。

1.1.3 供試藥劑及試劑 10%氟噻唑吡乙酮OD（增威贏綠），由科迪華農業科技有限公司提供；大麗輪枝孢激活蛋白（Verticillium dahliae Asp-f2 Like，VdAL），由北京中捷四方生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 待晚疫病菌在黑麥番茄培養基上生長至第10天時，用耙式牙簽［18］刮取菌絲的同時使用少量無菌水沖洗培養平板，再用400目無菌網篩過濾，然后定容至10 mL；使用血球計數板將濾液的孢子濃度調至1×104個/mL［19］，于4 ℃冰箱內釋放游動孢子40 min后用于接種［20］。

1.2.2 孢子囊懸浮液的制備 待晚疫病菌長滿平板表面時，用打孔器打取直徑為5 mm的菌餅，分別反貼于含有濃度為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L激活蛋白的培養平板中央，以無菌水為陰性對照，0.5 mL/L濃度的10%氟噻唑吡乙酮OD為陽性對照，每個處理3皿，重復3次，于20 ℃培養箱內黑暗培養10 d，采用十字交叉法［4］測量菌落直徑；測量菌落直徑后將培養平板上的菌絲全部刮取下，稱量菌絲重量；再按照1.2.1中的方法將菌絲制成孢子囊懸浮液，使用血球計數板檢測孢子囊濃度。

1.2.3 孢子萌發率的測定 按1.2.2中的方法制作孢子囊懸浮液，將孢子囊懸浮液與藥劑按體積比1∶1混勻，VdAL濃度分別設為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L，以無菌水為陰性對照，0.5 mL/L濃度的10%氟噻唑吡乙酮OD為陽性對照，每個處理3皿，重復3次。每個處理吸取30 μL混合液于干凈的凹玻片中，于4 ℃冰箱中培養4 h后觀察孢子囊的間接萌發情況，19 ℃培養24 h后觀察孢子囊的直接萌發情況，每個處理重復觀察100個孢子囊的萌發情況［21］。

1.2.4 盆栽試驗方法

1.2.4.1 試驗設計 試驗于云南農業大學溫室進行。選取健康發芽的種薯，種植在含有蛭石和珍珠巖（體積比為1∶1）的花盆中，每盆1株，定期進行水肥管理，保證馬鈴薯正常出苗和生長，在馬鈴薯植株出苗后第45天，將VdAL濃度分別設為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L，10%氟噻唑吡乙酮OD濃度設為0.5 mL/L，以無菌水為空白對照，使用以上濃度對植株進行整株噴施，每株用量150 mL，再在噴施24 h后，每盆植株接種15 mL的晚疫病菌孢子囊懸浮液［19］，每個處理3盆，重復3次。分別于接種晚疫病菌后第0、1、3、5、7、9天采取植株第3~5葉位上的葉片，液氮速凍后于-80 ℃中保存，用于測定防御酶活性和抗性物質含量。通過試驗可知，當VdAL濃度為20.0 mg/L時，晚疫病發病最輕。為探究VdAL對馬鈴薯晚疫病發生的影響機制，設置以下3個處理：20.0 mg/L VdAL處理24 h后接種晚疫病菌（T1）；0.5 mL/L 10%氟噻唑吡乙酮OD處理24 h后接種晚疫病菌（T2）；無菌水處理24 h后接種晚疫病菌（Q）。

1.2.4.2 病情指數和防治效果的測定 接種晚疫病菌后第10天觀察植株的發病情況，病情指數參考馬春暉等［22］的方法測定，病情指數和防治效果的計算公式分別為：

1.2.5 馬鈴薯葉片防御酶活性和抗性物質含量的測定 PAL、POD、PPO、CAT活性的測定分別采用苯丙氨酸法、愈創木酚法、兒茶酚法和鉬酸銨法［23-25］； MDA、SP含量的測定分別采用硫代巴比妥酸法和考馬斯亮藍顯色法［26-27］。

1.2.6 數據分析 用Excel 2007軟件和DPS 7.05軟件對數據進行統計整理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理對晚疫病菌的菌絲生長、孢子囊形成以及孢子囊萌發的影響

由表1~表2可知，2種藥劑中僅10%氟噻唑吡乙酮OD能對病原菌生長產生顯著抑制作用，含有0.5 mg/L 10%氟噻唑吡乙酮OD的培養基平板中的晚疫病菌無法生長，晚疫病菌生長至10 d時的菌落直徑、菌絲重量以及孢子囊濃度均為0，表明10%氟噻唑吡乙酮OD可以有效抑制晚疫病菌菌絲的生長和孢子囊的形成，并且該處理還可有效抑制晚疫病菌孢子囊的萌發，孢子囊直接萌發率和間接萌發率均為0，與Q和T1處理達到顯著差異。含有5.0~25.0 mg/L VdAL的培養平板中的晚疫病菌正常生長，與無菌水處理相比，晚疫病菌在生長至10 d時的菌落直徑、菌絲重量以及孢子囊濃度無顯著差異；此外，不同濃度VdAL對晚疫病菌孢子囊的直接萌發率和間接萌發率均無影響，表明VdAL對晚疫病菌無抑制作用。

表1 不同處理對晚疫病菌菌絲生長及孢子囊濃度的影響

表2 不同處理對晚疫病菌孢子囊萌發率的影響

2.2 不同處理對馬鈴薯晚疫病的防治效果

由表3、圖1可知，與Q相比，不同濃度的T1均可顯著減輕馬鈴薯晚疫病的發病程度，且發病程度隨著濃度的增加而逐漸減輕，但濃度高于20 mg/L后其防治效果有所降低。在經5.0~25.0 mg/L VdAL處理的植株中，其病情指數分別為47.73、42.46、41.76、38.47和40.72，可以看出20.0 mg/L是T1處理中的最佳作用濃度，其防治效果達到峰值，為39.14%，顯著高于其他濃度處理。T2處理后的病情指數為18.01，較Q顯著降低，其防治效果高達71.71%。雖然VdAL處理的防治效果低于10%氟噻唑吡乙酮OD處理的防治效果，但VdAL作為一種友好型生物農藥也可有效地防治馬鈴薯晚疫病。

表3 不同處理對馬鈴薯晚疫病病情指數和防治效果的影響

表4 不同處理對馬鈴薯葉片PAL活性的影響 U/(g·min)

圖1 不同處理的馬鈴薯植株晚疫病發生情況

2.3 不同處理對馬鈴薯抗病防御酶活性的影響

2.3.1 不同處理對馬鈴薯葉片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響 由表4可知：噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，馬鈴薯植株的PAL活性隨即升高，在第5天時達到峰值，分別為175.26、162.69和148.53 U/（g·min），其中T1的PAL活性最高，較T2和Q分別提高了7.73%和18.00%；5~9 d，3個處理的PAL活性均下降，第9天時3個處理的PAL活性非常接近?？梢钥闯?，相較于T2和Q，T1能更加有效地提升馬鈴薯植株的PAL活性。

2.3.2 不同處理對馬鈴薯葉片過氧化氫酶（CAT）活性的影響 由表5可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）處理后接種晚疫病菌，T1的CAT活性在1~5 d內呈現穩步上升的趨勢，且在接種第5天時CAT活性達到峰值，為31.94 U/(g·min)，較T2和Q分別提高了14.64%和15.77%；第5~9天T1的CAT活性呈現逐漸降低的趨勢，但仍高于同時間T2和Q的；T2和Q的CAT活性在接種后整體上也呈現出先升高后逐漸降低的變化趨勢，但變化幅度較小。上述結果說明T1提高馬鈴薯植株葉片CAT活性的效果最好。

2.3.3 不同處理對馬鈴薯葉片多酚氧化酶（PPO）活性的影響 由表6可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，馬鈴薯植株的PPO活性均呈現先升高后下降的變化趨勢，PPO活性在0~3 d內明顯升高；第1天時，T1的PPO活性為167.48 U/(g·min)，分別比T2和Q提高了7.41%和11.27%；第3天時，T1的PPO活性達到最大，為187.84 U/(g·min)，分別比T2和Q提高了11.96%和11.34%；隨后3個處理的PPO活性總體上逐漸降低，第5天時T1的PPO活性顯著低于T2的，但在其他時間點T1的PPO活性都顯著高于T2和Q的，說明T1最能有效提高馬鈴薯植株的PPO活性。

表5 不同處理對馬鈴薯葉片CAT活性的影響 U/(g·min)

表6 不同處理對馬鈴薯葉片PPO活性的影響 U/(g·min)

2.3.4 不同處理對馬鈴薯葉片過氧化物酶（POD）活性的影響 由表7可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，T1的POD活性在1~3 d內逐漸升高，第1天時，T1的POD活性為91.42 U/(g·min)，分別比T2和Q提高了17.54%和13.58%；第3天時，T1的POD活性達到最大，為93.37 U/(g·min)，分別為T2和Q的1.10倍和1.24倍；隨后T1的POD活性逐漸降低。T2和Q的POD活性總體呈現緩慢上升后逐漸減低的變化趨勢，但是變化幅度均小于T1的，說明T1最能有效提高馬鈴薯植株的POD活性。

表7 不同處理對馬鈴薯葉片POD活性的影響 U/(g·min)

2.4 不同處理對馬鈴薯抗病防御物質的影響

2.4.1 不同處理對馬鈴薯葉片丙二醛（MDA）含量的影響 由表8可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，T2的植株MDA含量在較低水平范圍內上下波動，T1的MDA含量呈現緩慢增加的變化趨勢，而Q的MDA含量迅速增加，且Q的MDA含量在整個處理期間均顯著高于T1和T2的，接種后第1天時，Q的MDA含量迅速升高，為36.27 mmol/g，分別比T1和T2提高了25.72%、36.56%；接種后第9天，Q的MDA 含量達到最高，為58.45 mmol/g，分別比T1和T2提高了26.98%、73.08%，說明T1和T2能有效降低馬鈴薯葉片中MDA的含量。

表8 不同處理對馬鈴薯葉片MDA含量的影響 mmol/g

2.4.2 不同處理對馬鈴薯植株可溶性蛋白（SP）含量的影響 由表9可知，噴施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和無菌水（Q）后接種晚疫病菌，T1和Q的SP含量在處理期間均呈現先升高后降低的變化趨勢，而T2的SP含量變化較小且持續維持在較低水平。接種后第0~3 天，T1的SP含量明顯升高，且第3天時SP含量達到最高，為12.97 μg/g，分別為T2和Q的1.21倍和1.12倍；第3~9天T1的SP含量逐漸降低，但降幅較小，其SP含量仍高于T2和Q的，說明T1最能有效提高馬鈴薯植株的SP含量。

表9 不同處理對馬鈴薯植株SP含量的影響 μg/g

綜上，大麗輪枝孢激活蛋白（VdAL）不直接作用于晚疫病菌，對晚疫病菌無抑制作用，但對馬鈴薯植株噴施VdAL后，第1~5天作用效果明顯，顯著提高了植株中的PAL、CAT、PPO、POD活性和可溶性蛋白（SP）含量，增強了植株的苯丙烷類途徑代謝，提高了植株及時清除因晚疫病菌侵染而產生活性氧的能力以及醌類物質合成的能力等；同時，VdAL處理能有效抑制植株的膜脂過氧化反應，顯著降低植株的MDA含量，進而增強馬鈴薯植株的抗性，減輕馬鈴薯晚疫病發生的程度，因此，利用VdAL來激發植株的抗病性，不僅可以有效緩解晚疫病的發生程度，還可以減少化學農藥的使用，在實現馬鈴薯晚疫病防控的同時達到保護環境的目的。

3 討論

植物激活蛋白能激活作物體內的生長和防御系統，在促進生長的同時增強作物的抗病性［28］。利用VdAL防治病害的研究已有報道，如VdAL誘導草莓對白粉病的抗性，防治效果達30.33%［5］；VdAL能顯著降低楊梅肉蔥病的發病率［17］。本研究發現VdAL對馬鈴薯晚疫病也具有良好的防治效果，其中噴施20.0 mg/L VdAL對馬鈴薯晚疫病的防效最好，達到39.14%，有一定的田間應用價值。

植物防御酶在植物抗病的生理反應過程中具有重要的作用，如PAL、POD、PPO、CAT等可參與木質素、植保素和總酚的合成、活性氧的清除等生理過程，從而達到增強植株抗病性的目的［29］。本研究發現噴施 20.0 mg/L VdAL后，可顯著提升馬鈴薯植株的PAL、CAT、POD、PPO等活性，增強馬鈴薯植株對晚疫病的抗性，這與李麗等［6,30］使用植物激活蛋白誘導植物提升抗病性的研究結果相似。

植物體內的SP和MDA含量均是與植株抗病密切相關的生理生化指標。植物體內的SP大多是參與各種代謝的酶類，與植物抗病性密切相關［19］。MDA是膜脂過氧化的最終產物，是反映植物生物膜受損傷程度的重要指標之一［29］。本研究發現馬鈴薯植株經20.0 mg/L VdAL處理后，植株的SP含量顯著高于10%氟噻唑吡乙酮OD處理和無菌水處理的，這可能是因為VdAL處理能有效提高植株的SP含量，具有增強植株抗病性的作用；同時，VdAL處理還可不同程度地降低馬鈴薯葉片的MDA含量，這可能是因為VdAL處理能提高馬鈴薯植株中的POD、CAT活性，及時清除超過閾值的H2O2，減輕病原菌侵染對細胞膜的傷害，進而減少MDA的積累。

綜上所述，VdAL能夠有效地誘導馬鈴薯植株增強對晚疫病的抗性，從而減輕晚疫病的發生。但本研究尚未對其他抗病機制進行深入研究，因此關于噴施VdAL后馬鈴薯植株防御基因的表達、防衛信號的識別和傳遞、代謝通路等方面的研究將是下一步研究工作的重點。此外，VdAL在大田生產中的應用技術也需要進一步的研究。

4 結論

大麗輪枝孢激活蛋白（VdAL）對馬鈴薯晚疫病菌的菌絲生長、菌絲重量、孢子囊形成以及孢子囊的萌發等均無影響，但VdAL對馬鈴薯晚疫病具有顯著的誘抗效果，可通過誘導植株提高防御酶活性和可溶性蛋白含量，降低植株的MDA含量，有效地增強馬鈴薯植株對晚疫病的抗性，可見VdAL能夠通過提高馬鈴薯植株的抗性來減輕晚疫病帶來的危害。