冷季不同飼養方式對阿什旦牦牛空腸差異蛋白的影響

張瑩瑩，張懷霞，謝 雯，任 昊，張春梅，陳 倩，賈建磊

(青海大學農牧學院，西寧 810016)

【研究意義】青藏高原地區海拔高，氣候寒冷，牧草生長期短，造成冷季(10月至次年6月)牧草匱乏，牦牛得不到足夠的供給會造成牦牛的生產效能低下甚至死亡，給牧民造成損失。為防止冬季虧損嚴重，有效的提高牦牛的生產效益和經濟效益，牦牛的舍飼和半舍飼就成了當下的一種趨勢[1-3]。反芻動物日糧需要攝入40%～70%的粗飼料，以維持正常的胃腸功能和消化道菌群環境，現代集約化飼養模式下，牦牛日糧精料超過75%[4]。長期的高精料喂養會導致亞急性瘤胃酸中毒等代謝疾病的發生，從而導致動物的機體和消化道受損，從而使牦牛的生產性能下降[5]。【前人研究進展】動物的腸道是動物消化系統的重要組成，對動物攝入的營養物質有吸收、代謝和維持機體免疫的功能。空腸是動物消化、吸收、代謝的重要場所，也是抵御有害物質進入機體對機體的損傷的重要屏障。空腸由單層上皮上細胞構成，易受到腸道內環境中pH和微生物等有毒有害物質的損傷，從而導致動物機體的損傷[6]。Jahan等[7]研究表明，高精料飼養公牛會導致瘤胃中NH3-N濃度上升，而NH3-N的含量可以直接反應瘤胃內環境的狀態；Li等[8]研究表明，精粗比能夠影響反芻動物瘤胃的pH，從而影響揮發性脂肪酸(VFA)和菌體蛋白的含量，菌體蛋白的濃度可以反映出瘤胃微生物利用氨態氮的能力。高精料的碳水化合物飼糧減少了其在瘤胃中的停留時間，使得大量的過瘤胃淀粉會進入到空腸，改變空腸內的發酵參數，使腸道的pH降低，揮發性脂肪酸(VFA)和脂多糖(LPS)濃度上升，引起腸道的酸中毒，從而破壞腸道上皮形態結構的完整性，使腸道屏障受損[9-10]。周力等[11]發現飼糧的精粗比可以顯著影響青海黑藏羊小腸的營養物質轉運載體基因的表達水平，進而影響黑藏羊小腸的代謝功能，精粗比為70∶30時效果較好；李巖等[12]發現飼糧的精粗比增加會抑制育肥后期牦牛對蛋白質的合成和對營養物質的消化，使牦牛的平均日增重和總增重降低。同時，Hristov等[13]發現長期的高精料舍飼喂養會導致動物機體代謝的紊亂，降低反芻動物的免疫能力，從而影響反芻動物的健康。此外，謝昕廷等[14]研究表明日糧精粗比會對牦牛肉的氨基酸和脂肪酸含量造成顯著的影響。【本研究切入點】通過蛋白質組學研究不同飼養模式下(自然放牧和高精料舍飼)牦牛空腸的蛋白質表達差異。【擬解決的關鍵問題】從分子生物學的角度去探索冷季長期高精料飼養對牦牛空腸的損傷，為合理科學的進行牦牛飼養，提高生產效益和經濟效益提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取海北藏族自治州天然放牧的條件下12只(4±0.5)歲左右的阿什旦公牦牛，隨機分為兩組，每組6只，試驗期為2018年11月16日至2019年5月4日，歷時180 d，前10 d為試驗組牦牛預試期，后170 d為正試期。

表1 試驗精飼料組成及營養水平(干物質基礎)

試驗組通過高精料舍飼的方式飼養，對照組為放牧飼養。對照組牦牛每天6:30放牧，20:00歸牧(歸牧后不補飼)。試驗組牦牛根據中國肉牛飼養標準(NY/T 815—2004)配制飼料，精飼料組成及營養水平見表1。粗飼料為玉米青貯和燕麥干草按1∶1比例混合，試驗期間每只牦牛每日飼喂4 kg精飼料和2 kg粗飼料(干物質)，每天按時飼喂2次(9:00和17:00)，兩組均自由飲水。

1.2 試驗樣品采集

飼養期結束后每組隨機選取3只牦牛，在夏華畜牧產業集團空腹電擊擊暈后頸動脈放血屠宰，試驗牦牛均已經經過國家動物屠宰檢疫總局(中國，青海)批準屠宰。在屠宰后迅速采集牦牛空腸組織樣本(前段、中段和后段各1 cm混合)，PBS沖洗干凈后裝入無菌凍存管中，將樣本存入液氮中帶回實驗室，-80 ℃保存備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質提取 蛋白質提取方法根據賈建磊等[15]組織蛋白提取方法進行空腸組織樣品總蛋白提取,每組3個重復。

1.3.2 蛋白質酶解和質譜分析 蛋白質酶解和質譜分析在北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行。根據超濾輔助樣品制備法對蛋白質進行酶解(每個樣品250 μg)，肽段采用流動相A相溶解后，使用EASY-nLCTM 1200 納升級UHPLC系統進行肽段分離，肽段分離后用Q Exactive TM HF質譜儀和Nanospray FlexTM(ESI)離子源對樣本進行分析，生成質譜原始數據。利用MaxQuant軟件分析質譜分析的數據，并與UniProt Bostaurus數據庫進行比較。

1.4 生物信息學分析

利用Blast2GO程序根據uniport數據庫對所有已鑒定蛋白進行細胞組分(CC)、生物學過程(BP)和分子功能(MF)分析。信號通路分析利用KEGG mapper平臺(http://www.genome.jp/kegg/mapper.html)Search pathway在線工具進行信號通路分析。利用String程序(http://string-db.org/)檢索相互作用基因/蛋白質，利用Cytoscape軟件對交互網絡進行圖形可視化和分析。

1.5 統計分析

數據測試完成后先采用Excel 2010表格進行初步統計處理，然后用SAS 9.2數據分析軟件進行獨立樣本t檢驗，結果均以平均值±標準差表示，顯著水平為P=0.05。

2 結果與分析

2.1 差異蛋白聚類分析

在不同飼養方式下(放牧飼養和全舍飼飼養)，檢測出不同飼養模式下牦牛空腸的差異表達蛋白共96種，采用FC(fold change)≥1.2且P≤0.05篩選上調表達蛋白，當FC≤1/1.2且P≤0.05篩選下調表達蛋白。樣本各差異蛋白相對含量聚類熱圖結果(圖1)表明，放牧飼養組(A)和全舍飼飼養組(B)呈現出2個明顯區別的亞類，較全舍飼組相比，放牧組有17種上調差異蛋白和79種下調差異蛋白。

不同顏色代表蛋白質的相對豐度，深紅色的代表較高的強度，藍色代表較低的強度，聚類枝越短相似度越高Different colors indicate the relative abundance of proteins, dark red represents higher intensity and blue represents lower intensity, and the shorter the clustering branch the higher the similarity圖1 放牧組(A)和舍飼組(B)差異蛋白聚類熱圖Fig.1 The heat map of differential protein clustering for grazing group (A) and confinedness group (B)

圖2 差異蛋白亞細胞定位分析Fig.2 Differential protein subcellular localization prediction

2.2 亞細胞定位分析

亞細胞定位分析(圖2)表明，差異表達蛋白中細胞質蛋白占23.54%，核蛋白占20.40%，線粒體蛋白占19.56%，細胞外蛋白占11.30%，質膜蛋白占7.53%，其他的所占比例較少。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 差異蛋白GO富集分析 GO分析(圖3)顯示，基于細胞組分分析，差異蛋白主要在細胞膜(Membrane)、細胞質(Cytoplasm)和線粒體(Mitochondrion)中富集。 基于分子功能分析，差異蛋白主要在氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)、細胞間粘著連接(Cell-cell adherens junction)、腺苷酸激酶活性(Adenylate kinase activity)、結合蛋白質(Protein binding)和結構分子活性(Structural molecute activity)中富集。基于生物過程分析，差異蛋白主要在細胞凋亡(Apoptosis)、炎癥反應(Inflammatory response)、細胞對脂肪酸的反應(Cellular response to fatty acids)、肌動蛋白細胞骨架重組(Actin cytoskeleton reorganization)和腺苷酸環化酶抑制G蛋白偶聯受體(Adenylate cyclase- inhibiting G protein-coupled receptor)中富集。

2.3.2 差異蛋白KEGG富集分析 96種差異蛋白主要在以下20種信號通路中的富集。其中去除疾病通路顯著富集的通路為：緊密連接信號通路(Tight junction signaling pathway)、NF-kB信號通路(F-kappa B signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、調控干細胞的多能性的信號通路(Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)。可知，KEGG通路分析與GO富集分析結果相匹配。

2.3.3 蛋白質互作分析 利用String程序和Cytoscape軟件對放牧飼養和全舍飼飼養的牦牛空腸的96種差異表達蛋白的互作作用進行分析，得出相應的互作信息(圖5)，確定了兩個主要主題：蛋白質結構(Occlusion，Claudin，Zo-1，ATP1B3和HKDC1)和炎癥反應(GPR41，IL-6，TNF-α和CCL5)，構成了一個復雜而強大的PPI網絡。

圖3 GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

圖4 KEGG富集分析Fig.4 KEGG pathways enrichment analysis

圖5 基于Cytoscape軟件的不同飼養模式下牦牛空腸提取物差異表達蛋白的蛋白質互作作用網絡Fig.5 Protein-protein interaction networks of the differential abundance proteins of different feeding groups in Yak jejunum based on Cytoscape software

3 討 論

空腸是動物消化吸收的主要場所，在消化系統中扮演者極其重要的角色，對牦牛來說極其的重要。近年來由于青藏高原冬季牧草不足的原因，更多的人選擇用舍飼和半舍飼的飼養方式來飼喂牦牛，以提高牦牛的經濟效益為自己減少損失[16]。同時舍飼飼養也可以提高牦牛的生產性能，使牦牛的日增重增加，但長期的高精料飼養模式很容易對動物的健康造成影響，也容易對動物腸道造成傷害[17]。空腸的機械屏障通過維持空腸粘膜的正常形態結構對空腸進行機械保護，一旦被破壞就會引起空腸功能障礙，導致腸上皮細胞被感染，致使緊密連接結構損傷，通透性增加和炎癥反應[18]，會促使腸道損傷，增加腸原性感染的發生[19]。

根據以上研究可以得出，靶蛋白可以分為兩個主題，分別為蛋白質結構通路(緊密連接信號通路，鈣信號通路和調控干細胞的多能性的信號通路)和炎癥反應通路(MAPK信號通路，趨化因子信號通路和細胞因子受體相互作用)。GPR41會在被瘤胃所消化的短鏈脂肪酸所激活，可以調控脂類的代謝，在腸道對于營養物質的消化吸收中起了重要的作用，作為營養能量調節受體影響了緊密連接的信號傳導通路[20-21]。GPR41也參與炎癥反應的調節，大劑量攝入可啟動腸上皮細胞的糖異生過程，激活緊密連接信號通路，然后調節下游相關細胞增殖和凋亡通路，降低緊密連接蛋白的表達，同時，GPR41介導調節性T細胞增殖并分泌大量的抗炎因子(IL-6，TNF-α，CCL5)，促進炎癥反應通路(MAPK)相關基因的表達，從而調節炎癥因子的表達[22-23]。在本研究中檢測到相對于放牧飼養組，在高精料的全舍飼飼養中GPR41明顯上調，可得出在高精料全舍飼飼養的牦牛空腸中會促進炎癥等一系列反應[24]。

本研究還測定出幾種差異蛋白：Occludin，Claudin，Zo-1，ATP1B3，HKDC1，IL-6，TNF-α和CCL5。在與放牧組相比，在高精料的全舍飼飼養條件下Occlusion，Claudin，Zo-1，ATP1B3和HKDC1的表達明顯下調，而IL6，TNF-α和CCL5則呈相反的趨勢。緊密連接蛋白是空腸機械屏障的重要組成部分，由轉運蛋白家族組成，包括Occludin，Claudin和Zo-1，主要參與腸細胞的增殖分化，凋亡和細胞旁路通透性調節，抵御大分子的入侵[25-28]。所以當Zo-1，Occludin和Claudin下調時會影響腸道機械屏障的完整性和通透性，增大了粘膜的通透性，會使得進入血液的病菌增多，促進炎癥反應從而對牦牛個體產生影響[29-30]。NF-κB信號通路是調控炎癥的主要通路之一[31]，發生炎癥反應之后NF-κB信號通路會被顯著激活誘導IL-6，TNF-α炎癥因子的表達，同時L6和TNF-α會促使T細胞產生淋巴因子，從而促進炎癥反應的進行[32]。CCL5對于白細胞的趨化作用，多聚的CCL5還會促進細胞的分化和生長，能夠激活炎性因子是炎癥反應過程中很重要的一個步驟[33]。所以IL6，TNF-α和CCL5的上調同樣也是在促進炎癥反應，容易對牦牛個體造成損害。

4 結 論

不同的飼養模式下篩選了牦牛空腸差異蛋白質96種，其中9種蛋白質(Occludin，Claudin，Zo-1，ATP1B3，HKDC1，GPR41，IL-6，TNF-α和CCL5)相對較活躍，并且與牦牛空腸屏障和功能損害有關。由此可得，長期高精料的全舍飼飼養模式會對牦牛的空腸造成一定的損害，高精料的全舍飼飼養只適合短期內的牦牛育肥，而不適合長期的牦牛養殖。