溶藻弧菌、LPS和Poly I:C對合浦珠母貝幾種抗氧化酶活性的影響

翟子欽,喻達輝,梁 霞,王 培,嚴雪瑜,周群玲,白麗蓉

(1.北部灣大學海洋學院,廣西 欽州 535011;2.廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室,廣西 欽州 535011;3.欽州市第一人民醫院,廣西 欽州 535000)

0 引言

合浦珠母貝(pinctadafucata)在中國主要分布在廣西、廣東以及海南的沿海地區,兼具養殖效益與生態效益。合浦珠母貝屬于無脊椎動物,它沒有特異性免疫系統,只有非特異性免疫系統[1]。近些年來,隨著海洋環境的變化,海水受到不同程度的污染,合浦珠母貝因為病害出現大量死亡。而目前對合浦珠母貝免疫防御機制的研究還比較薄弱。為了探討病害對合浦珠母貝的影響,提高合浦珠母貝的養殖效率,非常有必要對合浦珠母貝的免疫防御與調控機制進行深入研究。

外源物質主要通過刺激機體產生大量氧自由基來影響抗氧化平衡,從而引起應激反應[2],而抗氧化相關酶是天然免疫的重要效應因子。SOD是一種不可或缺的免疫相關酶,在生物體內是唯一一種以超氧陰離子作為底物的酶[3]。陳萍等[4]研究發現三疣梭子蟹感染溶藻弧菌后,其組織SOD 活性顯著降低。王麗等[5]通過對暗紋東方鲀腹腔注射LPS 后發現其肝、腎和鰓3 種免疫器官中的SOD 酶表達水平顯著提高。向軍喜[6]用Poly I:C 刺激黃姑魚后發現其肝中總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性提高。

CAT 的主要功能是催化功能,它可加快細胞內過氧化氫的分解,防止過多的氧化,從而保護生物體。栗志民等[7]通過不斷增加氨氮脅迫濃度,發現馬氏珠母貝血清的CAT 活性均表現出先顯著升高后下降的趨勢。李瓊珍等[8]通過對馬氏珠母貝限食處理發現其CAT 等酶的活性顯著下降,推斷限食可以顯著地降低插核手術貝的免疫活性。這些研究都說明了CAT 活性與珠母貝免疫功能之間存在相關性。華貴櫛孔扇貝被注射溶藻弧菌后血淋巴CAT 的活性有升高趨勢[9]。趙永偉等[10]發現,經過LPS 誘導,仔豬肝中的CAT活性顯著降低。以上研究表明溶藻弧菌、LPS 等刺激會影響動物CAT 的活性。

T-AOC 可以用于衡量機體的抗氧化酶系統的功能狀況,它的大小以及變化規律與生物體的健康密切相關[11]。張博等[12]通過研究發現插核后,合浦珠母貝各組織的T-AOC 與合浦珠母貝的氧化損傷程度相關,基本呈現下降—上升—下降的變化趨勢,這說明T-AOC 可以用于衡量合浦珠母貝的抗氧化能力水平。此外,相關研究表明溶藻弧菌、LPS 等會影響動物的T-AOC 活性。張櫻等[13]用溶藻弧菌感染三疣梭子蟹,發現T-AOC在血淋巴和肌肉中先升高后下降至正常水平之下,而在肝胰腺中則顯著降低。肉雞在LPS 刺激下其血漿T-AOC 水平極顯著降低[14]。

上述研究表明,免疫刺激會引起抗氧化系統的免疫反應。但目前合浦珠母貝抗氧化系統對免疫刺激的免疫反應研究報道較少。為此,本研究通過溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 刺激合浦珠母貝,測定不同時間點SOD、CAT、T-AOC 等免疫相關酶的活性變化情況,分析溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C脅迫對合浦珠母貝抗氧化酶活性的影響,探討免疫刺激對合浦珠母貝非特異性免疫作用的影響,研究結果可為深入研究合浦珠母貝的免疫防御機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在廣西北海市鐵山港養殖區,挑選購買300只外殼完好的二齡合浦珠母貝,于北部灣大學室內養殖系統充氣暫養1 周,每天換水1/2,投喂扁藻和小球藻。

1.2 實驗設計

隨機挑選暫養1 周的合浦珠母貝分為4 組,分別為PBS 組、溶藻弧菌組、LPS 組和Poly I:C組,每組100 只,每組3 個平行。PBS 組合浦珠母貝平均每只注射100 μL 磷酸緩沖鹽溶液(pH=6.8),溶藻弧菌組注射 100 μL 弧菌懸液(OD600=0.4),LPS 組注射100 μL LPS 溶液(1×10-3g·L-1),Poly I:C 組注射100 μL Poly I:C 溶液(1×10-3g·L-1),注射部位均為閉殼肌。各組分別在注射后0(未注射)、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 取血液,每個時間點取8只,液氮速凍,-80 ℃保存備用。

1.3 樣品處理及酶活性的測定

從-80 ℃冰箱取出樣品,裝入離心管后以2 000 r/min 離心10 min,取上清液,4 ℃保存用于酶活測定。SOD、CAT、T-AOC 活性測定均按照南京建成生物研究所研制的試劑盒說明書進行。

1.4 統計分析

利用Excel 和SPSS 22.0 軟件處理數據,運用單因素方差分析法和Duncan's 多重比較法進行顯著性分析和組間差異比較,*表示該組與對照組差異顯著(P＜0.05),**表示該組與對照組差異極顯著(P＜0.01)。

2 實驗結果

2.1 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝SOD 活性影響的實驗結果

由圖1可知,PBS 組和實驗組的SOD 活性均呈先下降后上升的變化趨勢。溶藻弧菌組在1 h、6 h、24 h 時,SOD 活性均比PBS 組低,在3 h、12 h、48 h、72 h、96 h 時,SOD 活性均比PBS 組的活性高,其中6 h SOD 的活性顯著低于PBS 組,48 h SOD 活性顯著高于PBS 組。除24 h 外,LPS組和Poly I:C 組的SOD 的活性均高于PBS 組,其中1 h 和48 h LPS 組的SOD 活性顯著高于PBS組,12 h 和48 h Poly I:C 組和PBS 組SOD 活性的差異極顯著。

圖1 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝SOD 活性的影響

2.2 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝CAT 活性影響的實驗結果

PBS 組和實驗組的CAT 活性均呈現先升高后下降的變化趨勢(見圖2)。溶藻弧菌組在3 h、6 h、12 h、72 h 時間段的CAT 活性均比PBS 組低,在1 h、24 h、48 h、96 h 時間段均比PBS 組高,其中96 h 的CAT 活性顯著高于PBS 組。LPS 組在1 h、6 h、24 h 時間段的CAT 活性均高于PBS組,3 h、12 h、48 h、72 h 和96 h 時間段,LPS 組的CAT 活性均低于PBS 組,但差異均不顯著。Poly I:C 組的CAT 活性在24 h、48 h 和96 h 時間段均高于PBS 組,在1 h、3 h、6 h、12 h 和72 h 時間段均低于PBS 組,但差異均不顯著。

圖2 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝CAT 活性的影響

2.3 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝T-AOC 活性的影響

實驗組和PBS 組在0～96 h 內T-AOC 活性的變化不大(圖3)。除96 h 外,溶藻弧菌組的T-AOC 活性均高于0 h 的活性,在12 h、96 h 時間段實驗組T-AOC 的活性均比PBS 組高,在3 h、6 h、48 h、72 h 時間段T-AOC 的活性均比PBS 組低,其中12 h T-AOC 的活性顯著高于PBS 組。除96 h 外,LPS 組的T-AOC 的活性均低于0 h 的活性,12 h 的T-AOC 活性顯著高于PBS 組,3 h、48 h和72 h T-AOC 的活性顯著低于PBS 組。除12 h、24 h、96 h 外,Poly I:C 組的T-AOC 的活性均低于0 h 的活性,12 h 和96 h 的T-AOC 的活性均顯著高于PBS 組,3 h、48 h T-AOC 活性顯著低于PBS 組。

圖3 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝T-AOC 活性的影響

3 討論

外源物質入侵會刺激動物機體代謝產生大量的氧自由基[15]。氧自由基能夠殺死細菌和惡性細胞,增強免疫,但含量過多時會與生物膜不飽和脂肪酸發生反應,造成機體過氧化損傷[16]。同時,機體內存在著抗氧化反應的酶防衛系統,通過清除多余的氧自由基來保護機體[17]。SOD 是生物體抗氧化系統的第一道防線,也是生物體中唯一具有特異性清除氧自由基的抗氧化酶。

3.1 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝SOD 活性影響的分析

翟秀梅等[18]研究表明感染弧菌會導致凡納濱對蝦的肝胰腺SOD 活性下降。隨著中國對蝦受鰻弧菌感染的時間延長,其SOD 活性呈先升高后降低的趨勢[19]。在本實驗中,在注射溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 后,合浦珠母貝的SOD 的活性均先降低后升高,這可能是由于注射外源物質使合浦珠母貝體內產生了大量的氧自由基,消耗了較多的SOD。面對外源脅迫,合浦珠母貝機體表現出積極的反應,為維持機體組織抗氧化水平平衡而引發的應對外界脅迫的生理調節,引發機體SOD 活性代償性升高,所以SOD活性回升。又因為外源刺激持續存在,但沒到完全致死的程度,所以合浦珠母貝的SOD 活性會波動。這與劉亞娟等[20]研究尖吻鱸在氨氮脅迫下的SOD 活性變化所觀察到的現象相似。同時也有研究表明,外源刺激會使機體SOD 等活性持續升高或降低。LPS 誘導離體大黃魚頭腎巨噬細胞的SOD 活性顯著下降[21]。趙燕靜等[22]在低氧環境下給淇河鯽魚注射Poly I:C 會誘導其肝胰臟的SOD 活性升高。這與本實驗研究結果不盡相同,可能是由于實驗刺激強度或時間長短、對象的不同所導致的。

3.2 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝CAT 活性影響的分析

洪婧妮等[23]利用弧菌感染大黃魚,發現在脾組織中的SOD 酶活性增高而CAT 酶活性降低,這表明生物體內的抗氧化酶防御系統是一個互補的統一整體,它們通過維持酶活性的動態平衡來抵抗外界損害。在本實驗中,外源脅迫使合浦珠母貝的活性氧自由基水平升高,SOD 把大量氧自由基轉化為過氧化氫和水,誘導CAT 的活性升高,催化過氧化氫分解,從而保護合浦珠母貝。南芝潤等[24]研究植物過氧化氫酶時發現,植物在干旱等不利環境條件下,機體受到影響時產生大量氧氣,這時通過CAT 發揮作用減少過多氧化來保護生物體,這與本次實驗結果相似。之后CAT 活性下降的原因可能是機體CAT 消耗增多,或者過氧化氫減少,產生的CAT 下降,這與周常義等[25]在研究三唑磷對泥蚶急性毒性及血清CAT 酶活性的影響結果相似。

3.3 溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝T-AOC 活性影響的分析

段亞飛等[26-27]研究發現,副溶血弧菌和鰻弧菌感染會導致斑節對蝦組織的T-AOC 活性呈先升高后下降的變化趨勢。大鼠心肌細胞的T-AOC 活性受LPS 誘導會顯著下降[28]。高春生等[29]在水體銅對黃河鯉肝胰臟抗氧化酶活性和總抗氧化能力的影響研究中表明,低濃度Cu2+溶液可增加黃河鯉的T-AOC 活性,高濃度Cu2+溶液會降低T-AOC 活性。這說明外源物質毒害作用較低時,可以誘導機體的積極反應,增加T-AOC活性,但毒害作用太大時就會降低T-AOC 活性。在本次實驗時間內,與實驗前相比,溶藻弧菌實驗組的T-AOC 活性總體升高,說明本實驗濃度的溶藻弧菌刺激性較小,可以誘導提高機體的總抗氧化能力;LPS 組和Poly I:C 組的實驗濃度相同,但LPS 組的T-AOC 活性總體降低,Poly I:C 組的T-AOC 活性時高時低,開始降低中期又回升,說明本實驗濃度的LPS 比Poly I:C 刺激性更大。

4 結論

綜上所述,溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 對合浦珠母貝的SOD、CAT、T-AOC 活性有顯著影響,隨著感染時間的延長會導致免疫酶活性變化,進而影響合浦珠母貝的非特異性免疫系統。合浦珠母貝的SOD、CAT、T-AOC 的活性對入侵機體的溶藻弧菌、LPS 和Poly I:C 反應較為敏感,可以作為免疫反應的生化指標。