堿性蛋白酶提取辣木籽多肽的工藝研究

鄭韻英,梁敏麗,莫柳艷,勞燕芹,胡漢嬌

(北部灣大學石油與化工學院,廣西 欽州 535011)

辣木籽為辣木的種子,呈球狀,直徑大概8 mm,其種子殼為褐色,有三棱,在種子的基部有膜質的翅[1]。辣木籽營養豐富,大量研究表明,辣木含有多種營養化學物質及人體所需的生命元素,如P、K、Mg、Na、Ca、Fe、Cu、Zn、Se 等元素[2]。辣木籽還有凈化水源[3]、抗菌[4]、抗癌[5]、抗病毒、抗氧化、護肝[6]、降三高[7-8]等功效。辣木籽中的各成分具有一定的生理和藥理作用,其中多肽具有抗氧化性、降血壓等功能和易吸收、無毒副作用等優點,廣泛應用于醫藥、化妝品、食品等行業[9]。

目前國內外對于生物多肽的提取方法主要有:酶解法[10]、堿溶酸沉法[11]、超聲波提取法[12]、微生物發酵法[13]等。如張靜等[14]用堿性蛋白酶直接水解制備得到花蕓豆多肽。周麗卿[15]采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆多肽獲得了較好的提取效果。聶艷峰等[16]在直接酶解的基礎上加入了超聲輔助功能來提取多肽以達到優化的目的。牟金秀[17]采用微生物發酵法對玉米多肽進行提取,獲得較高的轉化率。目前,對辣木籽的研究主要集中在蛋白質提取、油脂提取、營養功能、脂肪酸組成、多糖和多酚等方面,對辣木籽多肽進行提取的報道較少。本研究選用脫脂后的辣木籽粉為原料,采用超聲波輔助酶解法提取辣木籽多肽,為辣木籽功能化產品的生產提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:脫脂辣木籽粉(廣西習緣辣木有限公司),Gly-Gly-Tyr-Arg 標準品(上海麥克林生化科技有限公司);堿性蛋白酶(北京譜析標準技術有限公司);其余試劑均為優級純試劑。

儀器:HR/T16M 臺式高速冷凍離心機(湖南郝西儀器裝備有限公司);KQ-300DE 數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-2600紫外可見分光光度計(島津公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的測定

參考張靜等[14]關于多肽標準曲線試驗的方法,取一定量由100%三氯乙酸溶液稀釋成質量分數為5%的TCA 溶液,依次配制0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mg/mL 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準溶液;從10 mL 容量瓶中分別取6 mL 四肽標準溶液置于10 mL 離心管,同時加入4 mL 雙縮脲試劑,借助漩渦混合器使其混合均勻,靜置0.5 h 后于3 000 r/min 條件下離心5 min。測定吸光值,以肽的質量濃度為橫坐標x(mg/mL),吸光值為縱坐標y,制作標準曲線。

1.2.2 工藝流程

脫脂辣木籽粉→酶解提取→滅酶→辣木籽多肽酶解液→去蛋白→多肽含量測定。

1.2.3 多肽含量的測定

將經過去蛋白的上清液轉至50 mL 比色管中,用質量分數為5%的三氯乙酸水溶液定容到刻度線,搖晃使其混合。用10 mL 規格的移液槍從上述50 mL 溶液中移取6.0 mL 置于10 mL 離心管中(空白用5%TCA 代替);用5 mL 規格的移液槍移取4.0 mL 雙縮脲試劑加入,混合均勻后孵育30 min。在高速離心機3 000 r/min 條件下離心5 min,取上清液于540 nm 下測定吸光值,對照Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準曲線求得所測樣品溶液中多肽的質量濃度C(mg/mL),進而可求得樣品中多肽的含量。

式中:y表示樣品溶液中多肽的質量濃度,mg/mL;C表示標準曲線中得到的多肽質量濃度,mg·mL;n表示稀釋倍數。

1.2.4 堿性蛋白酶超聲輔助酶解脫脂辣木籽粉單因素研究

1.2.4.1 超聲溫度的確定

控制料液比為1 ∶40(g/mL)、超聲功率為240 W、酶添加量為1.75%、酶解pH 為10、酶解時間為60 min,超聲溫度為30、35、40、45 和50 ℃時對多肽質量濃度的影響。

1.2.4.2 超聲功率的確定

控制料液比為1 ∶40(g/mL)、超聲功率為240 W、酶添加量為1.75%、酶解pH 為10、酶解時間為60 min、超聲溫度為40 ℃,探究超聲功率為150、180、210、240 和270 W 時對多肽質量濃度的影響。

1.2.4.3 酶添加量的確定

控制實驗過程中的料液比、超聲溫度、功率、酶解pH 以及時間分別為1 ∶40(g/mL)、40 ℃、240 W、10、60 min,探究酶添加量分別為0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%、2.25%時,對多肽質量濃度的影響。

1.2.4.4 超聲時間的確定

控制其他變量一致:料液比為1 ∶40(g/mL)、超聲溫度為40 ℃、超聲功率為240 W、酶解pH 為10、酶添加量為2%,探究超聲時間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 和70 min 時對多肽質量濃度的影響。

1.2.4.5 pH 值的確定

控制其他變量一致,料液比為1 ∶40(g/mL),設定超聲波的參數為定值:溫度40 ℃、功率240 W、時間40 min,酶添加量為2%。探究pH 分別為7、8、9、10、11、12 時對多肽質量濃度的影響。

1.2.5 正交試驗

根據單因素實驗,選出超聲輔助酶解脫脂辣木籽粉效果影響較大的四個因素:超聲溫度(A)、超聲功率(B)、酶添加量(C)、pH(D)為自變量,以多肽含量作為評價指標來確定影響的水平,設計L9(34)正交表進行優化試驗(見表1)。

表1 正交試驗設計

1.3 數據處理

用Origin 2021 軟件處理數據繪圖,正交試驗用正交設計助手3.1 軟件。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

根據實驗結果,以Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準品繪制出標準曲線圖(見圖1),得到回歸方程y=0.134 9x-0.000 21,R2=0.997 0。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準曲線

2.2 堿性蛋白酶超聲輔助酶解脫脂辣木籽粉最優條件篩選

2.2.1 超聲溫度的選擇

如圖2所示,溫度在30～40 ℃時,由于溫度的提高,可以使分子運動加快,從而使酶活性增加,多肽質量濃度呈線性上升趨勢;在40～50 ℃時,多肽質量濃度呈下降趨勢,這是由于蛋白酶空間結構被破壞,部分酶變性失活。堿性蛋白酶的活性受到溫度的影響較大,溫度太高或太低都會使酶解反應的效果變得不理想。因此,選擇溫度范圍為35～45 ℃較適宜。

圖2 超聲溫度對多肽含量的影響

2.2.2 超聲功率的選擇

如圖3所示,超聲功率在150～240 W 時,由于超聲作用可以使分子運動加快從而使酶活性增加,多肽質量濃度呈線性上升趨勢;在超過240 W之后,多肽質量濃度呈下降趨勢。原因是過高的超聲強度導致部分溶液受熱的程度加快,破壞了多肽結構。與此同時,超聲產生的空化作用使酶結構被損壞,降低了酶活力。因此,選擇超聲功率范圍為210 ～270 W 較適宜。

圖3 超聲功率對多肽含量的影響

2.2.3 堿性蛋白酶酶添加量的選擇

如圖4所示,酶添加量為0.75%～2.25%。由于酶與底物結合的能力增大促進了酶解效果,多肽質量濃度呈穩定上升趨勢;在酶添加量2%之后,多肽質量濃度呈下降趨勢。原因是酶和底物的結合已經達到上限,這時過多的酶會抑制酶促效果。因此,酶的添加量在1.75%～2.25%較適宜。

圖4 酶添加量對多肽含量的影響

2.2.4 超聲時間的選擇

如圖5所示,超聲時間在不斷增加,酶和底物接觸的面積越發充分,同時,超聲的輔助蛋白酶的作用位點逐漸顯露出來,促進了酶解作用,多肽質量濃度呈迅速升高趨勢;在40 min 之后,多肽質量濃度呈下降趨勢,原因是酶解產物的累積和過度酶解成了寡肽。因此,選擇超聲時間為40 min。

圖5 超聲時間對多肽含量的影響

2.2.5 pH 的選擇

如圖6所示,堿性蛋白酶的酶解性能、水解效率的提升需要適宜的堿性環境,但過高的堿濃度會使蛋白酶本體結構發生改變,使其失活。pH 會顯著影響酶的活性,所以隨著pH 的增大多肽產生了先增后降的質量濃度變化,在pH 為10 時表現出最好的酶解性能。因此,選擇pH 的范圍宜為8～10。

圖6 pH 對多肽含量的影響

2.3 正交試驗分析

由表2的極差值可判斷出以上所選取的4 個因素都對辣木籽多肽的提取量有一定的影響。

表2 正交試驗結果

其大小順序為B＞A＞C＞D,即這幾個因素中影響最大的是超聲功率,其次是超聲溫度,再次是酶添加量,影響最小的是pH。正交實驗后各因素理論最優組合為A2B2C2D3,和單因素實驗做出來的最優結果一致,即超聲溫度為40 ℃、酶添加量為2%、超聲功率為240 W、pH 為10。選用正交實驗中所得的最佳組合條件進行平行驗證實驗,得到辣木籽多肽為9.12 mg/mL,優化方案具有一定的穩定性和可行性。

3 小結

本實驗以脫脂辣木籽粉為原料,研究了超聲波輔助酶解法在不同的超聲條件(溫度、功率、時間)、pH 和酶添加量因素下對多肽質量濃度的影響。在單因素的基礎上,設計L9(34)正交試驗,得到堿性蛋白酶提取脫脂辣木籽多肽的提取工藝在料液比1 ∶40(g/mL)、超聲溫度40 ℃、超聲時間40 min、酶添加量2%、功率240 W、pH=10 的情況下,多肽質量濃度高達9.12 mg/mL。本研究可為新種類功能化的多肽制備提供新思路,可為后續多肽的純化、多肽分子量的分布、抗氧化性等性能研究提供理論參考。