細菌性敗血癥疫苗在淡水魚類中的應用效果研究

郭少華，閆利萍，劉征權，馬文博，付美媛，趙平原，毛會麗，關建義

（新鄉醫學院生命科學技術學院，河南 新鄉 453003）

嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）和維氏單胞菌（Aeromonasveronii）隸屬于弧菌科，氣單胞菌屬，廣泛分布于各類養殖水體中，是常見的人-獸-魚共患病的病原菌，也是多種水生動物的條件致病菌[1-4]。嗜水氣單胞菌和維氏單胞菌可產生高毒性外毒素，如溶血素、腸毒素和蛋白酶等，能引起淡水魚類細菌性出血病，導致魚類大量死亡，給水產養殖業造成巨大的經濟損失[5-9]。此外，這2 種細菌也嚴重威脅人類的健康，可引起人類患胃腸炎、敗血癥、腹膜炎及外傷感染等疾病，因此一些國家已把嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌及其同屬菌作為水體質量和食品安全的檢疫對象[10-11]。目前，國際上已經建立了水生動物疾病檢疫網絡，應用免疫防治技術及綠色生物漁藥控制病害的發生，是當今世界水生動物疾病防控的研究重點，也是解決我國水產藥物濫用問題、促進水產養殖業可持續發展的重要技術保障[12-13]。因此，魚類疫苗已成為水生動物疾病防治領域研發的主流產品。

魚類疫苗的相關研究最早始于20 世紀40 年代。1942 年，加拿大學者Duff[14]首次成功研制出鮭產氣單胞菌滅活口服疫苗，開創了魚類疫苗的新時代。1975 年，疥瘡病ERM 疫苗由美國疫苗有限公司（AVL）成功研制，并獲得生產許可，開啟了魚類疫苗的工業化進程[12]。1984 年，在法國巴黎首次成功舉辦了魚類疫苗接種研討會，是魚類疫苗發展歷程中的重要里程碑[15]。進入21 世紀，魚類疫苗產業化發展迅速，全世界已有140 多種疫苗獲得生產許可證，在北美、東亞等多個主要養殖區建立了工業生產基地[16]。我國漁業疫苗的研究始于20 世紀60 年代[17]。1969 年，中國第一種魚類疫苗即草魚出血病組織血漿滅活疫苗（即“土法”疫苗）由珠江水產研究所研制成功[18]。1986 年，研制出免疫效果較好的草魚出血病病毒滅活疫苗[19]。20 世紀90 年代初，中華鱉嗜水氣單胞菌滅活疫苗和鱸鰻弧菌口服微膠囊疫苗研制成功[20-21]。目前，我國有5 種疫苗獲得了國家新獸藥證書。2011 年，我國2 種魚類疫苗獲得了生產經營許可，魚類疫苗行業產業化正式開啟。隨著國家提倡減少漁藥、大力推廣疫苗免疫，國內魚用疫苗研制也進入了快速發展階段。

國內水產疫苗中，注射疫苗的占比為79.0 %，浸泡與口服疫苗的占比為21.0 %[20]。為了解細菌性敗血癥二聯注射疫苗[22]在淡水魚類中的應用效果，在河南省新鄉市延津縣小楊莊開展了淡水魚免疫注射試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗塘

試驗地位于河南省新鄉市延津縣小楊莊，選擇6 口池塘，面積均為3 335 m2，水深均約 2 m，每口池塘均配置自動投料機1 臺、增氧機5 臺。魚塘每667 m2用100 kg 生石灰消毒，后注水，水源來自地下水。

1.2 試驗設計

對照組的 3 口（1#，2#，3#）塘未注射淡水魚細菌性出血病疫苗；試驗組的 3 口塘（1#，2#，3#）注射淡水魚細菌性出血病疫苗。

1.3 試驗時間

2019 年 4—11 月。

1.4 苗種投放

從本地選購個體健壯、無病的草魚（Ctenopharyngodon Idellus）、鰱（Hypophthalmichehys molitrix）和鳙（Aristichthys nobilis）。2019 年 4 月 20 日，每個池塘放養魚種11 500 尾左右（其中50 g 左右的草魚種 10 000 尾、150 g 左右的鰱種 1 250 尾、150 g 左右的鳙種250 尾）。

1.5 疫苗來源與接種

淡水魚細菌性出血病疫苗為嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌二聯滅活疫苗，由本實驗室制備。將嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌接種于LB 液體培養基，28 ℃培養16 h，加入終濃度為0.2 %的甲醛溶液，28 ℃搖床滅活 24 h，于 10 000 r/min 離心 20 min，收集菌株，加入磷酸緩沖液（PBS）至菌體濃度為1×108cfu/mL，經超聲破碎后制得嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌二聯滅活疫苗。將制備的疫苗涂布平板，28 ℃培養48 h 后，平板無菌落出現，證明完全滅活。在魚種投放前，用連續注射器對30 尾草魚腹腔注射制備的疫苗，用量為0.2 mL/尾。經觀察，草魚無異常反應且血清抗體明顯增加，證明疫苗安全無毒[23]。之后對魚種進行腹腔注射，每尾0.2 mL。

1.6 日常管理

日常投喂主要以顆粒飼料為主，青飼料為輔，投餌量根據水溫、天氣、魚類生長及魚攝食情況進行調整，每天 08：00、12：00 和 18：00 各投喂 1 次。在 4—11 月份定期換水，每次換水量為20～30 cm，每隔2 周全池潑灑1 次生石灰水調節水質，用量為每667 m21.0～1.5 kg，保持魚塘透明度為 35 cm 左右。每天清理投料臺區域并撈取塘中污物，保持養殖池塘水體潔凈；每天3 次巡塘，察看水體顏色變化、魚類攝食及活動情況，若發現異常，查找原因，及時采取措施。及時撈出池中死魚和重病魚，記錄數量，觀察、解剖和顯微檢測，確定其是否患出血病。

1.7 相對免疫保護率測定

試驗結束之后，排水撈魚，統計每種魚存活數量，計算試驗組與對照組草魚的存活率，按下列公式計算免疫保護率。

式中：SRP 為免疫保護率，%；RI為免疫組死亡率，%；RC為對照組死亡率，%。

1.8 魚類生長性能測定

在魚苗放養后的第 0，30，60，90，120，150 和180 天，分別從每個魚塘中隨機撈取30 尾，稱其質量，重復3 次，并記錄。計算放苗后第180 天時，魚類的各項生長性能指標。計算公式如下。

式中：WG 為凈質量增加量，g；RWG 為質量凈增加率，%；RSG 為特定生長率，%/d；F 為餌料系數；W0為初始平均體質量，g；WT為終末平均體質量，g；T 為飼養天數，d；FT為總投餌量，kg；WZ為總質量增加量，kg。

1.9 統計分析

使用軟件SPSS 24 進行單因素方差分析，試驗結果用（平均數±標準差）表示，組間差異采用LSD進行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 免疫效果

試驗期間，各養殖塘內的淡水魚均出現了不同程度的死亡現象，試驗組與對照組存活率見表1。由表1 可見，試驗組存活率高于對照組，且試驗組草魚的平均存活率同對照組相比極顯著提高了37.3%（P＜0.01），試驗組鰱和鳙的平均存活率同對照組相比極顯著提高了20.0%（P＜0.01）。淡水魚細菌性敗血癥疫苗對草魚、鰱和鳙的免疫保護率分別為95.0%，66.6%和80.7%（表2）。

表1 細菌性敗血癥疫苗對淡水魚存活率① %

表2 細菌性敗血癥疫苗對淡水魚的免疫保護率 %

2.2 發病情況

淡水魚的發病率見表3。由表3 可見，試驗中危害最大的疾病為出血病，其平均發病率為29.5%，占死亡總量的77.8%；腸炎病的平均發病率為5.3%，占死亡總量的14.0%；爛鰓病的平均發病率為1.9%，占死亡總量的4.9%。試驗組魚類發病率相較于對照組有極顯著的下降（P＜0.01），淡水魚類出血病、腸炎病、爛鰓病的平均發病率分別降低29.5%，2.8%和1.5%，并且其他病癥的平均發病率降低0.9%。

表3 淡水魚發病率 %

2.3 生長性能

于試驗第180 天計算試驗組與對照組生長性能的各項指標，結果見表4。由表4 可見，試驗組草魚的日質量增加量、凈質量增加量和質量凈增加率均極顯著高于對照組（P＜0.01），草魚的特定生長率高于對照組；試驗組鰱的日質量增加量和凈質量增加量高于對照組，質量凈增加率與對照組差異極顯著（P＜0.01），特定生長率與對照組差異不顯著（P＞0.05）；試驗組鳙的凈質量增加量和質量凈增加率高于對照組，日質量增加量與特定生長率與對照組差異均不顯著（P＞0.05）。在飼養周期中，對照組和試驗組的總投餌量分別是55 800 和 99 600 kg，餌料系數分別為 1.57 和 1.56。

表4 淡水魚的生長性能①

2.4 產量

試驗組和對照組養殖產量見表5。由表5 可見，對照組共計收獲商品魚35 453.0 kg，其中草魚、鰱和鳙的總產量分別為31 700.0，2 625.0 和1 128 kg。對照組每667 m2的產量為2 363.5 kg，其中草魚、鰱和鳙每667 m2的產量分別為2 113.3，175.0 和75.2 kg。試驗組共計收獲商品魚63 638.9 kg，其中草魚、鰱和鳙的總產量分別為58 835.9，3 375.0 和1 428.0 kg。試驗組每667 m2的產量為4 242.6 kg，其中草魚、鰱和鳙每667 m2的產量分別為3 922.4，225.0 和 95.2 kg。

表5 養殖產量 kg

2.5 效益

試驗組與對照組在池塘租金、用電成本、魚苗成本、人工成本、固定資產折舊等費用相同，試驗結果不統計上述費用。試驗結束時，草魚、鰱和鳙的市場價格分別為 12.6，4.0 和 10.0 元/kg。

試驗組和對照組養殖產值見表6。由表6可見，對照組總產值為42.12 萬元，其中草魚、鰱和鳙的產值分別為39.94 萬，1.05 萬和1.13 萬元。對照組每667 m2的產值為2.81 萬元，其中草魚、鰱和鳙每667 m2的產值分別為2.66 萬，0.07萬和0.08 萬元。試驗組總產值為76.90 萬元，其中草魚、鰱和鳙的產值分別為74.13 萬，1.35 萬和1.42 萬元。每667 m2的產值為5.13 萬元，其中草魚、鰱和鳙每667 m2的產值分別為4.94 萬，0.09 萬和0.09 萬元。

表6 養殖產值 萬元

試驗組和對照組養殖成本見表7。由表7 可見，對照組和試驗組總成本分別為22.70 萬和38.01 萬元，總收益分別為19.42 萬和38.89 萬元，每667 m2的收益分別為1.29 萬和2.59 萬元。

表7 養殖成本 元

3 討論

魚類疫苗可有效降低養殖業對環境的污染，同時無藥物殘留及耐藥性等問題[13]。在經濟效益方面，魚類疫苗成本低且免疫效果好[24-26]。本試驗使用的細菌性敗血癥疫苗為二聯疫苗，由滅活的嗜水氣單胞菌與維氏氣單胞菌混合而成，包含2 種抗原成分。試驗期間，注射淡水魚細菌性出血病疫苗的試驗組魚類，在養殖周期中發病率低，攝食旺盛，生長速度快，其中草魚平均免疫保護率達（95.0±1.2）%，成活率比對照組高出37.3%，鰱和鳙成活率比對照組高出20.0%。楊先樂等[27]開展的草魚出血病細胞培養滅活疫苗免疫試驗，免疫組成活率為79.5%；張玉芬等[28]開展的嗜水氣單胞菌疫苗免疫鯉試驗，免疫組鯉的存活率為90.0%，淡水魚細菌性出血病疫苗具有更好的免疫效果。在養殖產量和效益方面，試驗組均較高，其中總產量比對照組提高28 185.9 kg，總產值比對照組提高了34.78 萬元，總收益比對照組提高了19.47 萬元。整體上，淡水魚細菌性敗血癥疫苗安全有效[22]，在魚類病害防控、提高機體免疫力、提高生產效率及養殖效益等多個方面均有較好的效果。此外，試驗組藥物的用量遠低于對照組。因此淡水魚細菌性敗血癥疫苗的使用，可減少因水產養殖造成的環境污染，提高水產品質量。

4 結語

細菌性敗血癥疫苗在淡水魚類病害的生物防治中有良好的效果。不僅可以保護魚類的健康、提高魚類對病害的抵抗力、魚類成活率和產量，還可以減少養殖水體的用藥量，促進淡水養殖向綠色、健康、高產的方向發展。