FLOT1在結直腸癌中的表達及與預后、臨床特征關系研究*

郭旭利 郭曉紅 楊曉彬 袁樂中 查銀蓮 易智君

1 廣東省惠州市中心人民醫院腫瘤內科 516000； 2 惠州市惠城區水口人民醫院內科； 3 惠州市中心人民醫院病理科

結直腸癌是世界范圍內發病率排第4位的腫瘤，發病率及死亡率逐年攀升并嚴重威脅人類生命，也是導致中國人因癌癥死亡的第4大常見原因，也是第3大最頻繁診斷的癌癥[1]。結直腸癌主要據其臨床病理分期判斷治療方案和預后。但發現分期相同的患者生存時間有較大差別，有些術后分期早的患者反而較早出現復發。數據調查顯示，10%～20%的Ⅱ期和30%～40%的Ⅲ期結直腸癌患者在治療后復發，而有關結直腸癌發生發展及預后的研究仍較少[2]。FLOT1在多種惡性腫瘤中有異常表達，對治療方案、生存預后有指導意義[3]。FLOT1在結直腸癌中的表達特征及對結直腸癌預后的影響不明確，尋找與結直腸癌發展及預后相關的腫瘤標志物有利于分析腸癌的發病原因，指導制定治療方案及患者預后的評估。本研究使用RT-qPCR法研究FLOT1在結直腸癌及癌旁組織中表達的差異，旨在為臨床提供理論參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2019年1月—2020年12月收治的經病理結果證實的50例結直腸癌患者進行研究，經醫院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。所有患者中，男28例，女22例；年齡40～78歲，平均年齡(62.03±1.47)歲。所有標本經10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，連續切片，制成4μm厚切片備染。

1.2 研究方法

1.2.1 RT-qPCR法：提取總RNA并定量，反轉錄為cDNA。linc RNA FLOT1引物，上游5’-CACTGGGGAACTCTGACTCC-3’，下游5’-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3’；GAPDH引物，上游5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’，下游5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。PCR反應試劑：SYBR Premix Ex Taq(Tli RNas-e H Plus)，Ta Ka Ra Code：DRR420A去1μl的2×Prime STAR Max Premix，0.4μl的sense primer，0.4μl的anti-sense primer ，加滅菌蒸餾水至20μl，混合后離心。PCR反應體系，95℃下孵育30s，60℃下孵育20s，共進行40次循環反應；然后72℃下孵育20s，95℃下孵育15s后停止，使用熒光定量PCR方式處理試驗數據。

1.2.2 石蠟包埋組織免疫組化法：所采用的試劑Flotillin-1多克隆抗體購自Proteintech公司，枸櫞酸鹽抗原修復液(pH6.0)、DAB顯色液及PBS緩沖液均購自邁新公司。每個組織切片經脫蠟、枸櫞酸鹽抗原修復液熱修復，過氧化氫、牛奶封閉后滴加一抗(1∶200)4℃過夜。復溫后滴加二抗，37℃孵育10min，滴加HRP標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育3min，最后DAB顯色，蘇木精復染，中性樹脂封片。

2 結果

2.1 癌組織和鄰近的非癌組織中FLOT1 mRNA、FLOT1表達比較 結直腸癌組織FLOT1 mRNA水平、FLOT1高表達占比高于非癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織和鄰近的非癌組織中FLOT1mRNA、FLOT1表達比較

2.2 結直腸癌組織中FLOT1的表達與臨床病理特征的關系 浸潤程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期與FLOT1表達密切相關。見表2。

表2 結直腸癌組織中FLOT1的表達與臨床病理特征的關系

2.3 結直腸癌組織預后的影響因素 Logistic多因素回歸分析，FLOT1蛋白是結直腸癌患者的預后獨立影響因素(P<0.01)。見表3。

表3 結直腸癌組織預后的影響因素

3 討論

結直腸癌的分子標志物成為熱點，目前已有一些相關分子標志物被發現，但往往特異性較差，臨床應用價值相對較低。發現有效的結直腸癌分子標志物并將其作為診斷和預測疾病的依據，為患者提供合理有效的治療方案尤其重要[4]。因此，尋找特異性較好、臨床應用價值較高的分子標志物成為熱點。

諸多研究表明，脂質筏的蛋白質標記物參與人類癌癥各種各樣的生物學過程。Flotillin脂質筏家族成員FLOT1編碼一種Caveolae相關的完整膜蛋白，參與囊泡轉運和信號轉導[5]。既往研究曾對轉移性結腸癌細胞株SW620及原位結腸癌細胞株SW480外顯子蛋白譜進行對比分析，發現脂筏蛋白FLOT1在SW620中表達顯著升高[6]。最近，FLOT1在上皮源性癌中意外被發現，包括乳腺癌和食管鱗狀細胞癌等[7]。在肝癌細胞系中FLOT1在mRNA水平和蛋白質水平表達均升高。FLOT1的異位表達促進了食管鱗癌細胞系的增殖，而在體外和體內，沉默FLOT1可抑制乳腺癌細胞的增殖和致瘤性[8]。這些發現表明，FLOT1在上皮起源的腫瘤發生和發展中起著主導的積極作用，但是否也在人類結直腸癌中表達仍不清楚。本研究結果顯示，結直腸癌組織FLOT1 mRNA水平、FLOT1高表達占比高于非癌組織，差異有統計學意義(P<0.05)，說明了結直腸癌患者存在FLOT1高表達的情況。進一步分析結直腸癌預后的影響因素，結果顯示FLOT1是影響預后的獨立危險因素(P<0.01)，表明了FLOT1的表達，與結直腸癌患者的預后密切相關，臨床需加強對FLOT1表達的檢測，以此為臨床提供理論指導。

綜上所述，FLOT1在結直腸癌組織中存在高表達的現象，且與患者的預后及生存有明顯的相關性，可作為未來腫瘤分子生物標記物使用。