白芍總苷對TNF-α誘導Caco-2炎性細胞模型的作用機制

朱占榮 官 杰 吳艷敏 王 琪 羅曉慶 張 賀 王 慧

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種累及直腸、回腸、結腸的由免疫系統介導的慢性復發性腸道炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn′s disease，CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)[1]。本病特征為黏膜組織損傷和腸道炎癥，患者常出現體重減輕、腹痛、腹瀉、便血[2]。流行病學研究發現，近年來IBD發生率逐年上升，且呈現年輕化趨勢[3]。其發病機制尚未明確，大多與遺傳、免疫、感染、腸道微生物等多種因素密切相關[4]。本病病程長，易復發，給患者身心帶來較大痛苦。目前西藥治療以糖皮質激素類、氨基水楊酸、免疫抑制劑類為主, 其藥物療效不佳、不良反應較大、價格昂貴，而中醫藥在臨床應用中發揮多途徑、多靶點的藥用特性，凸顯其獨特優勢[5]。研究發現，白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)可通過下調腸黏膜急性損傷患者的炎性細胞因子表達，參與細胞信號轉導通路的調節，調節機體免疫功能[6]。然而，TGP在 IBD 中的作用機制尚不清楚。因此本研究采用TNF-α誘導Caco-2細胞制備炎性細胞模型，探究TGP對其保護機制，以期為研究中藥治療IBD提供新思路，同時為TGP的藥用價值提供理論依據。

材料與方法

1.實驗材料與試劑：人結腸細胞 Caco-2由中國科學院細胞庫(上海)提供；白芍總苷(H20055058)購自浙江寧波立華制藥有限公司；TNF-α(300-01A)購自美國Pepro Tech公司；MEM培養基(RNBJ5754)購自美國Sigma公司；胎牛血清(11011-8611)購自浙江天杭生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素(SC118-01)、脫脂奶粉(SW128-02)、二喹啉甲酸(BCA) 蛋白定量試劑盒(SW101-02)、胰蛋白酶(SC109-01)、ECL超敏化學發光試劑盒(SW134-01)均購自賽文生物科技有限公司；MTT(2016106)購自合肥白鯊生物科技有限公司；β-actin(abs839931ss)、β-actin 辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG(H+L)(ABS20039ss)、辣根酶標記鼠抗兔IgG(H+L)(ABS20040) 均購自上海愛必信生物科技有限公司；IL-6 ELISA檢測試劑盒(JL20896)、IL-1β ELISA檢測試劑盒(JL18442)均購自江萊生物公司；程序性死亡受體1(Beclin-1，D40C5)、微管相關蛋白輕鏈3B(LC3B,#3868)、Bcl-2(#4223)抗體購自美國CST公司。

2.細胞培養：Caco-2細胞接種于含20%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的MEM培養基，置于37℃、5% CO2、100%濕度培養箱中培養，細胞平均每兩天換液1次。待細胞生長密度達到70%～80%時，用1ml胰酶消化4min，用培養基終止消化，吹下細胞，收集。一般3～5天即可傳代1次，細胞代數控制在15～20代之間。

3. MTT法檢測TGP對TNF-α誘導Caco-2炎性細胞模型增殖的抑制：取對數生長期的Caco-2 細胞分別以10000個/孔接種于96板，每孔接種體積100μl。設對照組、模型組和給藥組，對照組給予常規培養液處理，模型組使用100ng/ml TNF-α損傷Caco-2細胞48h后，給藥組依次加入不同濃度(25、50、100、200、400μmol/ml)的白芍總苷培養。每組設3個復孔，外周一圈孔加PBS 200μl。分12h、24h、48h 3個時間點收集96孔板進行MTT法檢測細胞活力。操作過程為在每孔吸掉上清液100μl后加入20μl 0.5%的MTT溶液，繼續培養4h；吸去孔內培養液，每孔加入 150μl二甲亞砜(DMSO)，于微孔板振蕩器上振蕩5～10min，待紫色結晶物甲瓚充分溶解，測定 490nm 波長處的吸光度(A) 值，細胞活力抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%；計算白芍總苷對 Caco-2 細胞增殖的半數抑制濃度(IC50)，實驗重復3次。

4.ELISA法檢測各組IL-1β、IL-6水平：按上述步驟種板，按步驟3種板與分組，其中C組加入100μl 1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的MEM培養基培養，M組和給藥組用100ng/ml TNF-α損傷細胞48h后，給藥組依次加入白芍總苷低、中、高劑量組(50、100、200μmol/ml)培養48h后，取上清入滅菌過的EP管中，然后將上清液100微升/孔，用ELISA 試劑盒操作說明書步驟，每個樣品設復孔，測量各組上清液中IL-1β、IL-6的蛋白分泌水平，實驗重復3次。

5.Western blot法檢測各組中Beclin-1、LC3B、Bcl-2蛋白的表達：按步驟3種板與分組，收集各組細胞，提取總蛋白后，再用BCA定量試劑盒進行總蛋白定量。通過10% SDS-PAGE 凝膠分離相同量(20μg)蛋白質，樣品20μl上樣，加入緩沖液電泳， 然后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉后， 將膜與一抗(抗Beclin-1：1∶1000 稀釋、抗 LC3B：1∶1000稀釋、抗Bcl-2：1∶4000 稀釋、抗β-actin:1∶1000 稀釋)抗體結合4℃ 孵育過夜。TBST 洗滌膜后，加入過氧化物酶標記的二抗(1∶20000 稀釋)，加ECL顯色，使用BIO-RAD成像系統掃描和 Image J 圖像分析系統分析條帶。

結 果

1.不同濃度的TGP對TNF-α誘導Caco-2炎性細胞模型增殖的影響：MTT結果顯示，與給藥組比較，模型組細胞活力抑制率高，差異有統計學意義(P<0.05)。TGP濃度為25μmol/ml和400μmol/ml時，與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；當濃度50～200μmol/ml時，隨著濃度的增加細胞呈依賴性降低，可知，TGP濃度為50～200μmol/ml對受損的Caco-2細胞均有修復作用，其中以200μmol/ml作用最顯著(P<0. 05)，測得IC50為51.17μmol/ml；且TNF-α損傷Caco-2細胞作用48h的細胞活力抑制率約為25%，故選用作用48h細胞作為造模條件，選取TGP 50、100、200μmol/ml作為樣品處理濃度進行后續研究(圖1)。

圖1 不同濃度TGP對TNF-α誘導Caco-2炎性細胞增殖的影響(n=3)與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

2.ELISA法檢測各組IL-1β、IL-6水平：相對于對照組，模型組中 IL-6、IL-1β 分泌水平均明顯升高；與模型組比較，不同濃度的TGP(50、100、200μmol/ml)劑量呈依賴性地抑制IL-6、IL-1β 的分泌水平，差異有統計學意義 (P<0.05，表1)。

表1 各組細胞上清液中IL-6 和 IL-1β含量比較(μg/ml)

3.Western blot法檢測各組中Beclin-1、LC3B、Bcl-2蛋白的表達：與對照組比較，模型組中 Beclin-1、LC3B程度明顯升高(P<0.05)，與模型組比較，TGP低劑量組(50μmol/ml)、TGP中劑量組(100μmol/ml)、TGP高劑量組(200μmol/ml)分別呈劑量依賴地抑制Beclin-1、LC3B的蛋白的表達(圖2)。TGP低、中、高組可以顯著升高Bcl-2蛋白的表達(圖2)。且TGP高劑量組抑制效果最佳的作用優于中、低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05，圖2、圖3)。

圖2 Western blot法檢測各組中Beclin-1、LC3B、Bcl-2蛋白的表達1.對照組；2.模型組；3.TGP低劑量組(50μmol/ml)；4.TGP中劑量組(100μmol/ml)；5.TGP高劑量組(200μmol/ml)

圖3 Western blot法檢測各組蛋白表達柱狀圖A.Beclin-1；B.LC3B；C.Bcl-2。*P<0.05

討 論

鑒于 IBD 發病機制不明確，西醫治療多以調節腸道菌群、抗炎、免疫治療為主，難以根治。中醫學根據 IBD 臨床表現常見腹痛、腹瀉、黏液膿血便或里急后重等特點，將其歸于“腸風”“臟毒”“休息痢”等范疇[7]?！毒霸廊珪分姓撌觯骸皾袷t濡瀉，久泄皆屬于濕”，其認為病機為濕聚成濁，濁瘀成毒，升降失司，致腸炎久治不愈[8]。治以疏肝補脾、健脾化濕、化瘀通絡[9]。《神農本草經》言白芍：“主邪氣腹痛，除血痹，破堅積，寒熱疲，鎮痛，利小便，益氣”。歸肝、脾經，以養血斂陰，滋肝陰，緩急和中[10]。TGP是提取中藥白芍的具有多途徑抑制身體免疫反應的有效部位，現代藥理學研究表明，其主要含有芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷等多種單萜苷類化合物[11]。其有明顯的抗炎、鎮痛、免疫調節的作用[12]。另有研究發現，TGP在類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等疾病模型中，TGP通過下調TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性細胞因子的活性表達和細胞外調節蛋白激酶 (extracellular signal-regulated kinase，ERK) 通路，削減炎性細胞因子與免疫細胞相互作用，發揮抗炎作用,且有研究證實，使用TGP 150μmol/L可減輕腸道炎癥，防止腸道屏障受損[13, 14]。

本研究發現,TGP能降低Caco-2炎性細胞模型上清液中IL-1β、IL-6的含量表達水平。炎癥的惡性循環是IBD腸黏膜損傷的重要基礎,炎癥的激活可觸發自噬體的形成，TNF-α主要由巨噬細胞分泌，可促進炎性反應的發生[15]。當機體出現炎性反應時，誘導機體的巨噬細胞分泌過多的IL-6，而IL-6會促進IL-1β的生成，IL-1β是一種單核-吞噬細胞分泌的多肽調節因子，啟動機體免疫防御機制，在調節腸道炎癥免疫反應中起著關鍵作用[16]。本研究中使用TNF-α損傷Caco-2細胞48h后，細胞上清液中IL-1β、IL-6含量增加，說明誘導成為炎癥腸道損傷細胞模型。TGP給藥治療后，與模型組比較，IL-1β、IL-6顯著下調(P<0.05)。

自噬失調在IBD的發病機制中有重要影響。生理狀態下，自噬對腸上皮細胞發揮保護作用是通過清除機體有害物質(老化及死亡的蛋白質和細胞器)而維持機體內穩態的途徑來實現[17]。當自噬異常和持續性炎癥會促進IBD的發生、發展，例如可以通過調控mTOR/Beclin-1信號通路，防止過度活化的自噬激活炎癥小體，破壞腸上皮細胞屏障[18]。然而，炎癥的加劇可使腸上皮細胞內自噬過度活化，誘發IBD[19]。有研究發現，通過抑制炎癥體激活，調節自噬體且誘發細胞凋亡[20]?？芍允煽梢种蒲装Y相關信號轉導，而炎癥能夠激活自噬相關蛋白，進一步誘導細胞凋亡發生[21, 22]。Beclin-1和LC3B是自噬途徑的重要基因，Beclin-1被視為觀察自噬起始標志物，是啟動自噬的必要條件[23]。LC3B 作為細胞自噬的標志性蛋白，其含量與自噬小體數量呈正相關[24]。Bcl-2 不僅作為一個抗凋亡蛋白，同時，也被認為是一種抗自噬蛋白，Bcl-2通過結合Beclin-1發揮抑制自噬的作用，若破壞兩者復合物則導致自噬過度表達，促進細胞凋亡，引起細胞程序性死亡[25, 26]。本研究結果顯示，模型組IL-1β、IL-6含量增加的同時，Bcl-2 的表達降低，結合 Beclin-1的表達，可見 Bcl-2 過表達抑制了 Beclin-1，阻斷了自噬體的形成，導致自噬缺陷。TGP則通過抑制IL-1β、IL-6 分泌，上調抗凋亡基因 Bcl-2 表達，下調自噬相關蛋白 Beclin-1、LC3B的表達，發揮對自噬的抑制作用，維持機體內環境的穩定。

綜上所述，通過體外實驗初步驗證了TGP治療TNF-α誘導 Caco-2炎性細胞模型的作用與抑制炎癥及調節腸上皮細胞自噬有關。但由于本研究是初步結果， TGP是否可以調控自噬相關通路，有待于進一步探究。這也為后續的研究工作指出了方向。