羅非魚耐鹽數量性狀位點(QTL)定位研究

劉峰 余鈞劍 顧楠

(上海市水產研究所，上海市水產技術推廣站，上海 200433)

羅非魚(tilapia)是原產非洲、中東的部分麗魚科魚類的通稱，是世界重要的養殖經濟魚類，2018年全球羅非魚養殖總產量達到603萬t[1]。羅非魚是廣鹽性魚類，但耐鹽性狀的種間差異較大。其中，尼羅羅非魚為主養種，其生長速度快，但耐鹽性能較差[2-3]，只能在淡水或低鹽度水體中養殖[4]。莫桑比克羅非魚的耐鹽性較好[5]，可耐受120的鹽度[6]，在49鹽度下可正常繁殖[7]，并能適應淡水、半咸水、海水、高鹽水體等各種滲透壓環境[4]。由于淡水資源日趨緊張，且咸水中養殖的羅非魚品質優于淡水羅非魚，售價更高，因此，采用莫桑比克羅非魚等高耐鹽品種與尼羅羅非魚、紅羅非魚等生長速度快的品系進行雜交，再從雜交子代中進行耐鹽羅非魚的選育，已成為羅非魚育種重要的研究方向。

數量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)是控制數量性狀的基因或DNA片段所在的基因組區域。通過在參考群體中進行基因型鑒定及QTL定位分析，可獲得重要性狀的QTL，解析性狀差異的成因，QTL區域內與性狀相關的分子標記可用于分子標記輔助選育[8]。在QTL定位分析中，常用的分子標記主要有微衛星及單核苷酸多態性(SNP)標記[9]。采用傳統選育方法進行耐鹽羅非魚的選育，選育周期長、成本高，耐鹽性狀相關位點難以純合。若能篩選得到與耐鹽性狀相關的分子標記，再采用分子標記輔助選擇技術進行選育，可加速選育進程，并有利于在維持較高遺傳多樣性的基礎上對耐鹽性狀進行純化。本研究以耐鹽性好的莫桑比克羅非魚與生長快的紅羅非魚雜交建立參考家系，進行耐鹽QTL定位分析，所獲得的耐鹽相關QTL及耐鹽相關分子標記將有利于耐鹽羅非魚分子標記輔助育種。

1 材料和方法

1.1 試驗對象

以莫桑比克羅非魚為父本、紅羅非魚為母本，繁育獲得用于QTL定位分析的全同胞參考家系。從該家系中隨機選取300尾水花魚苗，放養于容量5 m3的循環水養殖系統中。養殖期間水溫25～28 ℃，每日投餌2次，采用淡水飼養至140日齡，存活的282尾個體均用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 耐鹽性狀測定和采樣

將所有試驗魚從淡水循環水養殖系統同時轉入容量5 m3的海水循環水養殖系統。海水養殖系統中提前加注鹽度為33的海水，足量充氧。觀察各個體的狀態，直至試驗魚死亡時將其撈出，記錄每尾魚的存活時間，作為耐鹽性狀表型值。根據生殖孔外觀及性腺形態鑒定各個體性別，剪取每一個體的部分尾鰭，保存于95%乙醇中用于DNA提取。

1.2.2 基因型測定與遺傳連鎖圖譜重建

采用Yue[10]的方法進行DNA提取。

篩選均勻分布于22個連鎖群、在至少一方親本中具有多態性的158個已發表的耐鹽羅非魚遺傳連鎖圖譜分子標記[11]及13個后續開發的微衛星分子標記(見表1)，對282尾參考家系個體進行第1輪基因型檢測。在前期的研究中，該參考家系的性別決定系統已被確認為XY型[12]，所有雌性的基因型均為XX型，所有雄性的基因型均為XY型，“性別”也被作為1個分子標記用于分析。首輪QTL定位分析后，為對第1連鎖群中鑒定得到的兩個QTL進行精細定位，從GenBank數據庫下載羅非魚全基因組序列，采用SiRoKo軟件在第1連鎖群中進行微衛星序列搜索，開發出19個微衛星分子標記(見表2)，再對各參考家系個體進行第2輪基因型檢測。

表1 首輪QTL定位用分子標記

表2 QTL精細定位用分子標記

在進行基因型檢測時，先采用熒光標記引物對各個體DNA進行PCR擴增，再采用ABI 3730測序儀對PCR擴增產物進行測定，內參采用GeneScan-500 ROX，基因分型軟件采用GeneMaper 4.0。微衛星分子標記開發方法與已發表的文獻[11]相同。

為排除不同家系重組率差異的影響，QTL定位分析前，先在參考家系中進行遺傳連鎖圖譜的重建。基于參考家系282個全同胞個體及親本的基因型，采用JoinMap 4.0軟件進行遺傳連鎖圖譜的構建，采用Kosambi作圖，標記分群閾值設置為LOD 4.0。作圖時，先根據母本、父本的基因型分別構建雌性、雄性圖譜，再對雌、雄圖譜進行合并，構建整合圖譜。遺傳連鎖圖譜的構建參照JoinMap 4.0使用說明進行。

1.2.3 QTL定位分析

QTL定位分析采用MapQTL 5.0軟件進行，相關方法參照軟件的使用說明。先將基因型數據及重建的遺傳連鎖圖譜從JoinMap軟件中導出，再與表型數據一起導入MapQTL軟件，然后進行后續分析。采用IM、MQM分析方法進行QTL定位，采用P-test分析確定基因組的顯著水平閾值。首輪QTL分析完成后，在選定QTL所在連鎖群中開發新的分子標記進行第2輪基因型檢測，基于兩輪基因型測定結果，對選定QTL進行精細定位分析，方法與首輪分析相同。

1.2.4 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據處理。均值結果以“平均值±標準差”表示，均值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，設顯著性水平為0.05。

平均存活時長=個體存活時間總和/個體總數

(1)

2 結果

2.1 參考家系耐鹽性狀

將參考家系轉入鹽度為33的海水后，經260 min出現第1尾死亡個體，之后死亡個體數逐漸增多，在410～434 min達到峰值。有小部分個體耐鹽能力較強，直至711 min，最后1尾個體死亡。所有個體的平均存活時長為417.4 min。各個體在海水中的存活時長分布如圖1。

圖1 各個體在海水中存活時長分布(死亡個體數量)

2.2 基因型檢測與連鎖圖重建

采用171個標記對282個參考家系個體進行第1輪基因型檢測，均在95%以上個體中獲得基因型。這些標記連同“性別”標記，共172個標記用于連鎖作圖。采用JoinMap軟件重建遺傳連鎖圖，獲得整合圖譜，該圖譜由22個連鎖群組成，包含172個標記。進行第一輪QTL分析后，采用第1連鎖群中新開發的19個分子標記，對282個參考家系個體進行了第2輪基因型檢測，并基于所有標記的基因型，再次進行了遺傳連鎖圖譜的重建。重建后的第1連鎖群包含29個分子標記(見圖2)，相關圖譜文件被用于后續的QTL精細定位分析。

圖2 重建的第1連鎖群圖譜

2.3 QTL定位分析

以各個體在海水中的存活時長作為耐鹽性狀，對檢測的所有參考家系個體進行QTL分析，獲得6個QTL，分別位于第1、12、21、22等4個連鎖群。其中，位于第1連鎖群的st-c的LOD值達到8.82，可解釋19.2%的表型差異(見表3)。

在本研究中發現，雌、雄魚的平均存活時長存在顯著差異(P<0.05)。為排除兩性差異對分析的干擾，獲得更多的QTL，對雌、雄魚分別進行了QTL定位分析。對雌性個體進行分析后獲得6個QTL，分別分布在第10、11、12、14、22等5個連鎖群；對雄性個體進行分析后獲得3個QTL，分別分布在第1、12、22等3個連鎖群，其中mst-a的LOD值達到6.29，可解釋19.1%的表型差異(見表3)。

表3 耐鹽QTL明細表

兩性耐鹽QTL st-c與雄性耐鹽QTL mst-a的LOD值較高，解釋的表型差異比例均大于19%，為主效QTL，因此選定這2個QTL進行進一步的精細定位。采用新開發分子標記進行第2輪基因型檢測后，基于所有分子標記基因型、重建的遺傳連鎖圖譜及各個體的表型值，采用MapQTL軟件的MQM方法進行定位分析，將st-c定位于第1連鎖群的32.11～33.12 cM，峰值位于32.13 cM，將mst-a定位于第1連鎖群的6.83 cM處(見表3)。在st-c中，位于峰值處的標記為“性別”標記；在mst-a中，位于峰值處的標記為鈉鉀氯協同轉運蛋白2(NKCC2)基因內含子中的1個微衛星標記(見圖3)。

注：圖中小寫字母為存活時間(ST)、雌性存活時間(F-ST)、雄性存活時間(M-ST)等三個性狀的QTL編號。

2.4 性別及NKCC2基因型對耐鹽性狀的影響

在282個參考家系個體中，雌性共156尾，雄性共126尾。對雌、雄魚的存活時長分別進行統計，結果表明，雌、雄魚在海水中的平均存活時長分別為394.0 min和446.7 min，二者差異極顯著(P<0.001)。

NKCC2基因內標記的檢測結果表明，在參考家系中存在A、B兩種NKCC2基因型。對所有個體進行統計，A型的平均存活時長為420.4 min，B型的平均存活時長為414.9 min，差異不顯著(P>0.05)；對雌性個體進行統計，A型的平均存活時長為395.6 min，B型的平均存活時長為385.3 min，差異不顯著(P>0.05)；對雄性個體進行統計，A型的平均存活時長為508.8 min，B型的平均存活時為431.0 min，差異極顯著(P<0.001)(見圖4)。

注：A、B為NKCC2的兩種基因型；***表示基因型間差異極顯著(P<0.001)。

3 討論

3.1 耐鹽羅非魚的選育與耐鹽QTL定位

羅非魚是典型的廣鹽性魚類，種類眾多，但僅有莫桑比克羅非魚等少數種類及佛羅里達紅羅非魚等雜交種適合在海水等高鹽度水體中養殖[13]。然而，莫桑比克羅非魚等耐鹽羅非魚生長較慢，在生產中應用的羅非魚養殖品系主要來自于耐鹽性較差的尼羅羅非魚及部分雜交種[14]。此外，采用海水或半咸水養殖的羅非魚沒有淡水養殖羅非魚常有的泥腥味，肉質更好[15]，售價高于淡水羅非魚。由于全球淡水資源缺乏，進行耐鹽羅非魚的選育與養殖已成為羅非魚產業的一個重要方向[5]。采用傳統方法進行羅非魚選育周期較長，如能開發耐鹽相關分子標記進行輔助選擇，則可加速選育進程。Jiang等[16]、Gu等[17]對耐鹽性較差的尼羅羅非魚及星洲紅羅非魚進行了耐鹽QTL定位研究，在尼羅羅非魚的LG14及LG18中定位了2個QTL，在星洲紅羅非魚LG18中定位了1個QTL。本研究以高耐鹽的莫桑比克羅非魚與低耐鹽的紅羅非魚雜交建立參考家系，并進行耐鹽QTL的定位分析，從中篩選得到15個耐鹽QTL，分布于LG1、LG10、LG11、LG12、LG14、LG21、LG22等7個連鎖群，這些QTL中的分子標記將可用于耐鹽羅非魚分子標記輔助選育，促進羅非魚耐鹽機理的研究以及耐鹽羅非魚新品系的快速選育。

3.2 NKCC2與羅非魚耐鹽性狀

鈉鉀氯協同轉運蛋白(NKCC)是一類進行鈉、鉀、氯離子跨膜轉運的蛋白，在脊椎動物的體液平衡中起到極為關鍵的作用，主要包括NKCC1、NKCC2兩種[18]。NKCC1主要在魚類的鰓部表達，與鰓的氯離子分泌有關[19]。NKCC2主要在腸、腎中表達，通過氯離子的轉運促進水的吸收[20]。海水中生活的歐鰻，在黃鰻、銀鰻兩個時期，其腸NKCC2的表達量均顯著高于淡水中生活的個體[20]；海鯛(SparusaurataL.)在鹽度55條件下腸NKCC2的表達量為鹽度12條件下的3倍[21]。這些研究均表明，NKCC2在魚類的滲透壓調節及海水適應中起到非常重要的作用。本研究中發現，NKCC2基因位于第1連鎖群的主效QTL mst-a峰值處，該QTL可解釋雄性耐鹽性狀19.1%的表型差異；NKCC2的A、B兩種基因型在雄性中的耐鹽性狀差異極顯著，但在雌性中的差異不顯著。這些結果表明，NKCC2的基因差異很可能決定羅非魚耐鹽性狀的部分個體差異，且性狀差異的大小與性別存在一定關系。本研究開發的NKCC2基因內標記可作為重要候選分子標記用于羅非魚耐鹽性狀的分子育種。

3.3 羅非魚耐鹽性狀的兩性差異

本研究在第1連鎖群定位了1個主效耐鹽QTL st-c，可解釋兩性耐鹽性狀的19.2%，QTL的峰值處為“性別”標記，該標記代表著1個XY性別決定位點。對雌、雄羅非魚耐鹽性狀的統計表明，羅非魚具有顯著的兩性耐鹽差異，從淡水直接轉入海水后，雌性和雄性羅非魚的存活時長分別為394.0 min和446.7 min，二者差異極顯著。這些結果表明，雄性羅非魚的耐鹽性狀顯著優于雌性。已有研究表明，柳、青楊等植物具有顯著的兩性耐鹽差異[22-23]，但至今為止，鮮有魚類兩性耐鹽差異的研究。本研究中發現的羅非魚兩性耐鹽差異的形成機理還有待進一步研究。

本研究結果表明，在半咸水或海水中進行羅非魚的養殖，選擇全雄群體具有一定的耐鹽優勢。