鯉春病毒血癥病毒生物學(xué)研究進(jìn)展

劉佳 盧玉婷 劉蕓娜 閆子豪 汪惠慶 李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118)

鯉春病毒血癥(Spring Viraemia of Carp，簡(jiǎn)稱SVC)是由鯉春病毒血癥病毒(Spring Viraemia of Carp Virus，簡(jiǎn)稱SVCV)引起的1種急性、出血性疾病，該病毒屬于彈狀病毒科，其病毒粒子長(zhǎng)80～180 nm，直徑60～90 nm，鯉科魚類易感染此病，其他科魚類及兩棲類也有感染此病毒的報(bào)道。SVC傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，死亡率高，一旦暴發(fā)，養(yǎng)殖魚死亡率可達(dá)90%以上[1-2]。鯉春病毒血癥是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)必報(bào)的動(dòng)物疫病。早在1992年我國就將其列為二類動(dòng)物疫病，并收錄進(jìn)《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》，2008年又將其列為一類動(dòng)物疫病。

SVC一旦暴發(fā)會(huì)嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，深入研究SVCV的致病機(jī)制對(duì)于鯉春病毒血癥的防治具有重要意義。本文從SVCV的流行特點(diǎn)、傳播方式、臨床癥狀、生物學(xué)特征、基因組特征和蛋白結(jié)構(gòu)特征等方面進(jìn)行綜述，旨在為該病的后續(xù)研究提供參考。

1 流行特點(diǎn)、傳播方式和臨床癥狀

1.1 流行特點(diǎn)

SVC分布地域較廣，主要流行于歐洲和中東地區(qū)，目前有報(bào)道的國家包括奧地利、匈牙利、保加利亞、法國、德國、英國、意大利、西班牙以及捷克、斯洛伐克和俄羅斯的部分地區(qū)[2]。此外，1998年英國環(huán)境、漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)研究中心(The Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science,簡(jiǎn)稱CEFAS)從來自中國北京的金魚和錦鯉中分離出病毒，并鑒定為SVCV[3]。1930年，SVC在歐洲首次發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)人們稱該病為傳染性水腫，但這一觀點(diǎn)爭(zhēng)議較大，僅被少數(shù)人接受。隨后，1971年南斯拉夫的Fijan[4]在發(fā)生急性水腫的魚體中分離出SVCV病毒，被世界公認(rèn)為首次發(fā)現(xiàn)。SVCV宿主廣泛，包括鯉、鰱、鳙和草魚等經(jīng)濟(jì)魚類，也包括錦鯉和斑馬魚等觀賞魚類，其中鯉科魚類最為易感。SVCV通常在春季、水溫為12～22 ℃時(shí)暴發(fā)，在寒冷的冬季后，水溫開始回升，當(dāng)水溫升高到15～17 ℃時(shí)魚的發(fā)病率及死亡率最高，尤其幼魚最為明顯。當(dāng)水溫高于17 ℃時(shí)，成魚很少發(fā)病，但幼魚在水溫20～22 ℃時(shí)也會(huì)感染此病并有死亡。當(dāng)溫度升至22 ℃以上時(shí)，SVCV雖然可感染仔魚，但不會(huì)造成養(yǎng)殖魚類大規(guī)模發(fā)病，可能是由于水溫較高時(shí)，魚類機(jī)體代謝旺盛，免疫反應(yīng)較為強(qiáng)烈[5]。據(jù)報(bào)道，該病對(duì)歐洲1齡鯉魚的影響重大，據(jù)估計(jì)1齡鯉魚的損失在10%～15%，相當(dāng)于每年4 000 t左右[6]。

1.2 傳播方式

SVCV傳播方式包括水平傳播和媒介傳播，以水平傳播為主。水平傳播的主要傳染源包括病魚和死魚等。媒介傳播包括生物性媒介和非生物性媒介，生物性媒介主要包括水蛭和魚虱等，非生物性媒介則主要為水[7]。在自然條件下，病毒可以通過鰓侵入魚體內(nèi)，在鰓上皮細(xì)胞中增殖，并且儲(chǔ)存在痊愈的魚體內(nèi)，這種魚即成為病毒攜帶者。SVCV可通過糞便、尿液、鰓和皮膚黏液等分泌物排出體外，可在水中保持感染活性4周以上，在4～10 ℃的泥漿中保持感染活性6周以上[8]。

1.3 臨床癥狀

魚類感染SVCV后主要表現(xiàn)為攝食減少，游動(dòng)緩慢，不能對(duì)外界刺激及時(shí)做出反應(yīng)，身體平衡能力下降，出現(xiàn)側(cè)游現(xiàn)象，甚至只臥于池底，基本不游動(dòng)。病魚臨床癥狀表現(xiàn)為：眼球突出，腹部膨脹，肛門紅腫，皮膚、鰓、眼睛及內(nèi)臟有出血點(diǎn)或出血斑，通常體色發(fā)黑、鰓絲蒼白，肌肉因出血而呈紅色，內(nèi)臟水腫、有出血斑點(diǎn)，其中以鰾最為常見，脾臟腫大、粗糙變形，肝壞死；組織病理變化表現(xiàn)為：肝實(shí)質(zhì)充血、多灶性壞死和脂肪變性，脾臟充血，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞明顯增生，淋巴管擴(kuò)張，內(nèi)充滿淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞碎片，胰腺發(fā)生多灶性壞死和非化膿性炎癥，心肌變性。小腸絨毛萎縮，腎小管阻塞，空泡和透明樣變[9-10]。

2 病毒特征

2.1 基因組特征

目前，GenBank中主要有16株SVCV全基因序列(截至2020年)，其中11株來自中國(見表1)，各基因間親緣關(guān)系進(jìn)化樹見圖1[11]。SVCV的基因組為線性、單股不分段的負(fù)鏈RNA，核苷酸數(shù)約為11 kb，包含5個(gè)開放閱讀框，從3′端到5′端基因的排列順序?yàn)椋?′-N-P-M-G-L-5′，依次編碼SVCV核蛋白(nucleoprotein，N)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)、糖蛋白(glycoprotein，G)和RNA聚合酶蛋白(RNA polymerase，L)(見圖2)[12]。SVCV基因組中各個(gè)基因之間的連接區(qū)相對(duì)保守，均以2個(gè)核苷酸(C、T)為間隔，但G-L的連接以4個(gè)核苷酸(C、T、A、T)為間隔[13]。SVCV基因組的前導(dǎo)區(qū)有69個(gè)核苷酸，其中60～64位是N基因的轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)AACAG，這在每個(gè)基因中是一致的，拖尾序列長(zhǎng)49個(gè)核苷酸，含有L基因的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TATG(A)7，其末端存在著與前導(dǎo)區(qū)反向互補(bǔ)的核苷酸序列，這是彈狀病毒基因組的1個(gè)主要特征，也是不分段負(fù)鏈RNA病毒的共同特征[13]。

表1 GenBank中16株SVCV全基因序列表[11]

注：SVCV-shlj4于2020年10月剛提交至GenBank中，本文未對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

(a)病毒結(jié)構(gòu)模型；(b)基因組組織顯示編碼的蛋白質(zhì)、基因連接以及前導(dǎo)區(qū)和尾區(qū)

2.2 結(jié)構(gòu)蛋白特征

核蛋白N由418個(gè)氨基酸組成，是病毒雙螺旋核衣殼的主要成分，相對(duì)保守，常用N基因作為靶標(biāo)來檢測(cè)SVCV，且準(zhǔn)確檢出率高。

磷蛋白P由309個(gè)氨基酸組成，磷蛋白P與核蛋白N和RNA聚合酶蛋白L蛋白結(jié)合形成核蛋白顆粒。核蛋白顆粒負(fù)責(zé)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。

基質(zhì)蛋白M由223個(gè)氨基酸組成，M蛋白參與SVCV的組裝和出芽。有研究報(bào)道，M蛋白可引起細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞病理效應(yīng)中起重要作用[14]。

糖蛋白G是病毒主要外膜蛋白之一，由509個(gè)氨基酸組成，位于病毒粒子表面，是病毒結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組成部分。G蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合并介導(dǎo)病毒內(nèi)吞作用，幫助病毒侵入動(dòng)物細(xì)胞，其構(gòu)象變化將由內(nèi)體酸化引發(fā)，使病毒基因組從核內(nèi)體釋放到細(xì)胞質(zhì)中[15]。它攜帶中和抗原決定基，是DNA疫苗開發(fā)的潛在靶點(diǎn)。

根據(jù)G蛋白的基因序列，可進(jìn)一步將SVCV分為Ia、Ib、Ic、Id等4個(gè)基因組[3]。Ia型病毒主要從英國、中國、美國和加拿大分離得到，Ib型和Ic型主要來自摩爾多瓦、烏克蘭和俄羅斯等地分離的病毒株，Id型主要來自英國、德國和奧地利。SVCV進(jìn)化聚類與地理分布密切相關(guān)，可能是不同地域病毒獨(dú)立進(jìn)化的結(jié)果。不同亞型的SVCV以不同的速度進(jìn)化，Ia型被認(rèn)為是最活躍的，有證據(jù)表明，Ia型的P基因和G基因的核苷酸突變率約為Id型的3.5倍，Ia型又進(jìn)一步分為Iai和Iaii兩個(gè)亞群。其中，從中國分離的4株SVCV分別為A1、A2、BJ0505-2和SVCV-265，經(jīng)鑒定，SVCV-265為Iai亞群，A1、A2、BJ0505-2為Iaii亞群。全基因重組分析發(fā)現(xiàn)，A2、BJ0505-2株為A1株與SVCV-265同源重組后代，重組部位分別位于A2的3 845～6 387 bp和BJ0505-2的3 573～6 444 bp[16]。

RNA聚合酶蛋白L由2 095個(gè)氨基酸組成，是SVCV中最大的1個(gè)蛋白，因基因序列較長(zhǎng)，存在一次性克隆難、多次克隆連接難等問題，目前對(duì)其功能性的研究相對(duì)較少。

3 檢測(cè)技術(shù)

目前，SVCV血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有病毒中和試驗(yàn)(NT)、免疫過氧化物酶試驗(yàn)(IP)、免疫熒光試驗(yàn)(IF)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。然而，這些技術(shù)存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力且SVCV抗血清的效價(jià)不高等問題[13]。SVCV和梭子幼魚彈狀病毒(Pike fry rhabdovirus,PFRV)具有共同的抗原決定簇，在IF和ELISA中發(fā)生交叉反應(yīng)，兩者很難區(qū)分[17]。PFR不是OIE必須申報(bào)的疫病。應(yīng)用核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)(RPA)可成功鑒別包括SVCV和PFR在內(nèi)的13種具有交叉反應(yīng)的硬骨魚病毒。此外，RPA還揭示了不同品種鯉魚和不同地點(diǎn)的SVCV分離株之間具有遺傳多樣性。近年來，也有應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)獲得針對(duì)SVCV的抗體來檢測(cè)病原，且該技術(shù)特異性強(qiáng)，無交叉反應(yīng)，為SVCV的檢測(cè)奠定了簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的基礎(chǔ)，有待于大范圍推廣使用。

SVCV的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要基于PCR檢測(cè)技術(shù)高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，包括逆轉(zhuǎn)錄PCR、套式PCR、多重實(shí)時(shí)定量RT-qPCR、TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR等。Oreshkova等[18-19]利用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)構(gòu)建了M基因和G基因生物素標(biāo)記的DNA探針，用斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)SVCV，該方法檢出的樣品病毒滴度TCID50達(dá)到105/g。高隆英等[20]報(bào)道了采用RT-PCR擴(kuò)增G基因片段來檢測(cè)SVCV，Koutna等[21]將RT-PCR與套式PCR技術(shù)相結(jié)合，能夠快速可靠地檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)和感染組織勻漿里的SVCV。PCR檢測(cè)技術(shù)雖然特異性強(qiáng)、靈敏度高，但需要專門的儀器、熟練的操作手法以及無該病原污染的環(huán)境等，這些條件制約了該技術(shù)的應(yīng)用[22]。

與嵌套式RT-PCR技術(shù)相比，RT-LAMP技術(shù)具有更高的特異性和敏感性，具有所需設(shè)備簡(jiǎn)單廉價(jià)、可以在養(yǎng)殖場(chǎng)輕松操作等優(yōu)勢(shì)，已成功應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治。此外，該技術(shù)引入了納米生物檢測(cè)方法，在特定條件下，單鏈或雙鏈寡核苷酸可與金納米粒子在膠體溶液中雜交。Saleh等[23]利用這種特異性雜交分析方法直接檢測(cè)臨床樣本中的SVCV，而無須擴(kuò)增病毒RNA，該方法的特異性達(dá)100%，且不需要熱循環(huán)儀器，測(cè)試時(shí)間也更短(15 min)。

4 疫苗的研究

疫苗的研制開發(fā)是控制疫病暴發(fā)的有效策略，然而，目前尚未有能有效預(yù)防SVCV感染的疫苗。限制此種類疫苗開發(fā)的問題是滅活疫苗保護(hù)率低、減毒疫苗對(duì)病毒減毒不當(dāng)?shù)取NA疫苗作為1種能夠有效替代傳統(tǒng)疫苗的疫苗而受到廣泛關(guān)注。但SVCV的DNA疫苗保護(hù)效果不理想，明顯低于其他彈狀病毒科疫苗。Kanellos等[24]根據(jù)SVCV的G蛋白設(shè)計(jì)了10種DNA疫苗，其保護(hù)率僅為11%～33%；而使用表達(dá)全長(zhǎng)G基因的二聯(lián)疫苗時(shí)，其保護(hù)率提高到48%。由于魚的黏膜組織對(duì)抵御病原體入侵有重要的作用，黏膜免疫的激活可以防止病原體感染，這是注射疫苗無法達(dá)到的，因此，口服疫苗的研發(fā)成為新的研究方向。有研究顯示，1種轉(zhuǎn)基因植物乳酸菌共表達(dá)SVCV-G蛋白和錦鯉皰疹病毒ORF81蛋白對(duì)鯉魚和錦鯉免疫65 d后的有效保護(hù)率分別為71%和53%[25]，被免疫鯉魚的免疫球蛋白M表達(dá)明顯升高。這些結(jié)果表明，口服疫苗具有良好的免疫效果，且免疫過程簡(jiǎn)單，避免了注射疫苗時(shí)的機(jī)械損傷，有望在日后的研究?jī)?yōu)化后成為商業(yè)化疫苗。

5 展望

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖迅速發(fā)展的今天，如何將產(chǎn)出最大化是我們一直追求的目標(biāo)。面對(duì)SVCV對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大經(jīng)濟(jì)損失，如何有效治療SVC仍然是水產(chǎn)養(yǎng)殖亟需解決的難題之一。當(dāng)前，針對(duì)SVCV的防控主要采取消滅傳染源、切斷傳播途徑及保護(hù)易感魚群等方法措施，并沒有高效的防控方法，加強(qiáng)檢疫和免疫防控仍是防控SVC的主要手段，因此，需進(jìn)一步優(yōu)化鯉養(yǎng)殖環(huán)境因子、營(yíng)養(yǎng)指數(shù)、群體行為特性的各技術(shù)環(huán)節(jié)，智能化監(jiān)測(cè)鯉健康養(yǎng)殖過程中的各類參數(shù)，動(dòng)態(tài)調(diào)整鯉預(yù)防技術(shù)指標(biāo)[26]。此外，治療藥物及商業(yè)化疫苗的開發(fā)和研制具有很大的發(fā)展前景。目前，對(duì)SVCV基因組序列、蛋白組成和病毒結(jié)構(gòu)的研究已比較明晰，但其致病途徑和機(jī)理尚需進(jìn)一步深入研究。