四川地區(qū)結(jié)核分枝桿菌katG、inhA和rpoB基因突變位點(diǎn)耐藥水平及突變頻率特征分析

陳蕾

結(jié)核病是威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題之一，隨著耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)患者的日益增多，結(jié)核病防控工作面臨前所未有的挑戰(zhàn)。2020年，世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道全球MDR-TB或利福平耐藥結(jié)核病(RR-TB)的治療成功率為57%，我國(guó)僅為54%[1]。對(duì)此類肺結(jié)核的早期、快速診斷有利于臨床采取有效、合理的治療方案，而可靠的分子或表型藥敏方法是確診MDR-TB或 RR-TB以及選擇藥物的重要工具[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道基因芯片技術(shù)對(duì)MDR-TB的診斷具有快速、靈敏、高通量等許多優(yōu)點(diǎn)[3]，不同抗結(jié)核藥物的耐藥相關(guān)基因在耐藥突變株中發(fā)生的頻率差異較大，且引起的耐藥水平也存在差異性[4-5]。因此，本文采用基因芯片法(芯片法)通過katG、inhA和rpoB基因突變位點(diǎn)檢測(cè)耐藥基因，微孔板比例法(比例法)通過培養(yǎng)+藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)表型耐藥水平，分析基因突變位點(diǎn)與耐藥水平關(guān)系及突變頻率分布特點(diǎn)，為本地區(qū)臨床治療方案選擇提供指導(dǎo)。

資料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

收集2020年1月至2021年1月成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心住院肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，選取經(jīng)液體培養(yǎng)陽(yáng)性且菌種鑒定為人型結(jié)核分枝桿菌(Mtb)的分離株，進(jìn)行比例法檢測(cè)H或R耐藥性為表型耐藥，同時(shí)完成芯片法檢測(cè)H或R耐藥基因?yàn)橥蛔冃停灿?jì)獲得118例Mtb菌株(患者118例)。

二、儀器和試劑

儀器：結(jié)核分枝桿菌耐藥DNA芯片檢測(cè)試劑盒、PCR擴(kuò)增儀、芯片雜交儀、微陣列芯片掃描讀片儀均由北京博奧生物技術(shù)有限公司提供；BACTECTMMGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)/藥敏系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BD公司。

試劑：試驗(yàn)所用分枝桿菌液體MGIT培養(yǎng)基由美國(guó)BD公司提供。

三、檢測(cè)方法

1 標(biāo)本采集 按照結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作流程[6]收集合格的痰標(biāo)本，標(biāo)本量3～5mL，對(duì)不合格的標(biāo)本重新留取。對(duì)同一份痰標(biāo)本進(jìn)行比例法檢測(cè)耐藥表型、芯片法檢測(cè)耐藥基因。

2 微孔板比例法檢測(cè)H和R耐藥表型

采用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)基，按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[7]的要求進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)產(chǎn)物均使用硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)指示劑初步鑒定為Mtb和非結(jié)核分枝桿菌。將分離的Mtb菌株，采用微孔板比例法，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]的要求進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。判斷耐藥標(biāo)準(zhǔn)：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上菌落數(shù)≥1%為生長(zhǎng)。對(duì)照管生長(zhǎng)，含藥濃度管不生長(zhǎng)為敏感，含藥濃度管生長(zhǎng)為耐藥。2種含藥液體培養(yǎng)基的藥物高低濃度分別為H0.80 μg/mL、0.40 μg/mL,R 8.00 μg/mL 、4.00 μg/mL。

3 基因芯片法檢測(cè)katG、inhA和rpoB基因突變位點(diǎn)

取1 mL標(biāo)本按基因芯片儀器使用操作說(shuō)明測(cè)試。通過檢測(cè)位點(diǎn)的突變情況判斷耐藥性，如R耐藥相關(guān)基因ropB基因511(T→C)、513(C→A)、516(G→T,A→T,A→G)、526(C→T,C→G,A→T,A→G)、531(C→T,C→G)、533(T→C)位點(diǎn)及H耐藥相關(guān)基因katG基因的315(G→C,G→A)位點(diǎn)和inhA基因的-15(G→T)位點(diǎn)。如果耐藥相關(guān)基因?yàn)橐吧停袛酁橄鄳?yīng)藥物敏感，如耐藥相關(guān)基因?yàn)橥蛔冃停袛酁橄鄳?yīng)藥物耐藥。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，理論頻數(shù)1≤T<5，計(jì)算校正χ2值，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多組計(jì)數(shù)資料兩兩比較采用P值修正的方法，即三組之間兩兩比較P<0.05/3=0.0167認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本情況

納入分析的118例Mtb菌株中，H耐藥株85例，R耐藥株99例，MDR株66例。男性85例，占72.03%(85/118)，女性33例，占27.97%(33/118)。年齡11～88歲，平均年齡42±11.28歲。患者分別來(lái)源于成都地區(qū)47例(39.83%，47/118)，三州地區(qū)32例(27.12%,32/118)，四川其他地區(qū)14個(gè)地級(jí)市共計(jì)39例(33.05%,39/118)。

二、H耐藥相關(guān)基因katG、inhA基因突變位點(diǎn)與表型耐藥水平的關(guān)系

H耐藥株85例中，單基因耐藥株84例(98.82%,84/85),其中katG71例(84.52%，71/84)、inhA13例(15.48%，13/84)。雙基因耐藥株1例(1.18%,1/85)。總體高濃度耐藥(高耐藥)71例(83.53%，71/85)，低濃度耐藥(低耐藥)14例(16.47%，14/85)。不同單基因突變位點(diǎn)耐藥水平比較，katG與inhA高耐藥率分別為92.96%(66/71)、30.77%(4/13)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雙基因耐藥株1例為高耐藥(見表1)。

表1 katG、inhA單基因位點(diǎn)與表型耐藥水平的關(guān)系

三、R耐藥相關(guān)基因rpoB基因突變位點(diǎn)與表型耐藥水平的關(guān)系

R耐藥株99例中，單基因耐藥株95例(95.96%,95/99),其中ropB531位點(diǎn)49例、ropB526位點(diǎn)22例、ropB533/516/513/511位點(diǎn)24例。雙基因耐藥株4例(4.04%,4/99)。總體高耐藥77例(77.78%，77/99)，低耐藥22例(22.22%，22/99)。不同單基因突變位點(diǎn)耐藥水平比較，rpoB531、rpoB521、rpoB533/516/513/511高耐藥率分別為93.88%(46/49)、81.82%(18/24)、37.5%(9/24)，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較中，ropB531與ropB533/516/513/511 及ropB526與ropB533/516/513/511 比較高耐藥率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0167)；ropB531與ropB526 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0167)。雙基因耐藥株4例均為高耐藥(見表2)。

表2 rpoB單基因位點(diǎn)與表型耐藥水平的關(guān)系

四、katG、inhA和rpoB基因位點(diǎn)突變頻率

118例患者標(biāo)本進(jìn)行耐藥基因突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)，芯片法檢測(cè)H耐藥株85例中katG基因315單位點(diǎn)突變率最高達(dá)84.43%(71/85)，其次為inhA基因-15單位點(diǎn)13.93%(13/85)，最低為雙基因katG315+inhA-15位點(diǎn)1.64%(1/85)。R耐藥株99例中基因位點(diǎn)突變率從高到低依次為ropB531單位點(diǎn)49.50%(49/99)、ropB526單位點(diǎn)22.22%(22/99)、ropB511單位點(diǎn)11.11(11/99)、ropB516單位點(diǎn)8.08(8/99)、ropB533單位點(diǎn)3.03(3/99)、ropB513單位點(diǎn)2.02(2/99)；雙基因和多基因位點(diǎn)突變率分別為3.03%(3/99)、1.01(1/99)。MDR株66例中耐藥基因位點(diǎn)突變率從高到低依次為katG315+ropB531位點(diǎn)43.94%(29/66)、katG315+ropB526位點(diǎn)21.21%(14/66)、katG315+ropB511位點(diǎn)6.06%(4/66)及inhA+ropB5316.06%(4/66)、katG315+ropB533位點(diǎn)4.55%(3/66)及katG315+ropB516位點(diǎn)4.55%(3/66)及inhA+ropB526位點(diǎn)4.55%(3/66)、katG315+ropB513位點(diǎn)1.52%(1/66)；多基因位點(diǎn)突變率7.58%(5/66)(見表3)。

表3 katG、inhA和rpoB基因位點(diǎn)突變頻率

討 論

異煙肼耐藥相關(guān)基因katG和inhA的耐藥水平比較

Mtb的耐藥主要是藥物作用靶基因突變引起的。H耐藥主要途徑：H需要經(jīng)Mtb觸酶-過氧化物酶活化后才發(fā)揮作用，該酶由katG基因所編碼，katG基因突變導(dǎo)致90%以上的H耐藥株產(chǎn)生，其最普遍的變異發(fā)生在第315位點(diǎn)上，表型耐藥水平為中等到高水平耐藥[9]。本文中katG基因高濃度耐藥率92.96%明顯高于inhA基因30.77%，與其他研究者耐藥水平略有差異，但總體一致[10-11]，說(shuō)明katG基因有總體耐藥水平高的特點(diǎn)。但該位點(diǎn)71株中仍有5株為低濃度耐藥，提示katG基因其他位點(diǎn)上存在變異，導(dǎo)致Mtb對(duì)H產(chǎn)生不同水平的耐藥性和保留不同的觸酶-過氧化物酶活性。其次途徑：inhA基因的調(diào)節(jié)序列上發(fā)生單堿基插入變異時(shí)，使inhA蛋白過度表達(dá)從而使H活性不同程度的降低，導(dǎo)致10%左右的H耐藥株產(chǎn)生，其表型耐藥水平大多數(shù)為低水平耐藥[9]，本次研究中inhA低耐藥率69.23%(9/13)也證實(shí)了這一特點(diǎn)。本文inhA-15位點(diǎn)13株中仍有4株為高濃度耐藥，提示inhA基因低耐藥有不穩(wěn)定性的特點(diǎn)。 此外雙基因katG+inhA突變株也為高濃度耐藥，提示當(dāng)單獨(dú)存在katG基因突變或inhA啟動(dòng)子合并katG基因突變時(shí)耐藥水平較高，表明高劑量異煙肼是無(wú)效的，因此在MDR-TB和RR-TB患者中，不應(yīng)使用全口服MDR-TB短程方案[12]。本地區(qū)katG、inhA基因突變位點(diǎn)總體高濃度耐藥率達(dá) 83.53%,也進(jìn)一步提示本地區(qū)使用高劑量異煙肼必須結(jié)合快速分子藥敏檢測(cè)，在H敏感或低濃度耐藥時(shí)才能慎重使用。

利福平耐藥相關(guān)基因ropB各突變位點(diǎn)耐藥水平比較

R耐藥主要途徑：R與MtbDNA依賴的RNA聚合酶β亞單位(ropB)結(jié)合后抑制其活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡。β亞單位由ropB基因編碼，其核心保守區(qū)域出現(xiàn)突變?cè)斐?7%的R耐藥株產(chǎn)生，最集中的突變位于531或526位點(diǎn)，并導(dǎo)致高度耐藥，而511、516、518和522位點(diǎn)與低水平耐藥相關(guān)[13]。本文中ropB531、ropB526高濃度耐藥率分別為93.88%、81.82%，兩者高耐藥水平相似，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均遠(yuǎn)高于rpoB511/513/516/533位點(diǎn)耐藥水平，此外雙基因3株及多基因1株突變株全部為高濃度耐藥，均與ropB531、ropB526位點(diǎn)突變有關(guān)。6位點(diǎn)總體高耐藥率達(dá)77.78%，提示本地區(qū)R耐藥位點(diǎn)耐藥水平高，臨床使用必須規(guī)范 治療同時(shí)加強(qiáng)藥敏檢測(cè)，避免耐藥產(chǎn)生。

katG、inhA和rpoB基因位點(diǎn)突變頻率比較

本研究收集的住院患者來(lái)自四川省各地，成都地區(qū)、三州邊遠(yuǎn)地區(qū)、四川其他地區(qū)分別占39.83%、27.12%、33.05%，能較好代表四川地區(qū)地域分布特點(diǎn)。在耐藥基因位點(diǎn)突變頻率分布中發(fā)現(xiàn)：四川地區(qū)H耐藥相關(guān)基因以單基因突變?yōu)橹鳎琸atG主要突變形式為(AGC→ACC) Ser→Thr(S315T),占H耐藥突變株的84.43%，其次為inhA突變率13.93%，雙基因突變率僅有1.64%； R耐藥相關(guān)基因rpoB也以單基因突變?yōu)橹鳎饕蛔冃问綖镽RDR-531(TCG→TTG) Ser→Leu,占R耐藥突變株的55.81%，其次為526、511位點(diǎn)突變率分別為13.95%、11.11%，雙基因及多基因位點(diǎn)突變率僅有4.04%；MDR耐藥相關(guān)基因主要突變形式為katG315+ropB531，占MDR耐藥突變株的43.94%。這與揚(yáng)州、深圳、海南等地區(qū)頻率分布不盡相同，提示katG、inhA和rpoB基因位點(diǎn)突變頻率分布存在地域性差異[14-16]。

總之，四川地區(qū)H、R耐藥株的耐藥水平高，基因突變位點(diǎn)與耐藥水平密切相關(guān)。katG、rpoB531/526與H、R 高耐藥水平有關(guān)，inhA、rpoB511/513/516/533與H、R 低耐藥水平有關(guān)。katG315、rpoB531是H、R耐藥相關(guān)基因突變的主要形式，臨床使用抗結(jié)核藥物須密切結(jié)合快速藥敏檢測(cè)制定方案。本次研究由于樣本量局限未能進(jìn)一步研究突變頻率較少的H、R耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)對(duì)不同表型耐藥水平的影響，希望在以后進(jìn)一步開展相關(guān)研究。