短時高壓電場處理對萌發甜蕎γ-氨基丁酸積累的影響

楊尚儒，辛鎮忠，王 越，王 愈

（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 太谷 030801）

蕎麥（Buckwheat），屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）。主要有甜蕎（F. esculentum Moench）與苦蕎（F. tataricum）兩個栽培品種，在我國乃至世界范圍都有廣泛種植。甜蕎是一種常見的營養豐富的雜糧，其中的GABA對人體有著重要調控功能。在脊椎動物體內，GABA作為抑制性神經遞質，可以降低神經元活性，并與腦部抗焦慮受體結合，在其他物質的協調作用下達到鎮靜神經改善腦功能的作用[1]。國內外多項研究表明：糙米、黑米等谷物、大豆、綠豆等豆類及苦蕎和大麥等麥類經萌發后GABA含量會得到提升[2]。高立城等的研究表明，甜蕎經萌發后氨基酸種類不發生變化，但部分氨基酸含量會上升；黃酮含量表現出先下降后上升的趨勢；蛋白質含量呈現先上升后下降后又上升的趨勢；脂肪和淀粉表現出整體下降的趨勢[3]。種子萌發后生理活性增加，多種代謝途徑激活，與未經萌發處理的種子相比，營養成分發生改變，包括GABA在內的多種功能性成分含量提升，而部分抗營養因子含量降低[4]。GAD是影響甜蕎萌發過程中GABA積累的主要酶，甜蕎經萌發后生物活性提高、多種酶被激活，GAD催化甜蕎籽粒中的L-谷氨酸轉化為GABA；GABA經過GABA-T的催化形成琥珀酸半醛（SSA）；SSA進一步被SSADH催化形成琥珀酸并進入三羧酸循環，這個流程被稱為GABA支路[5]。合適的萌發處理條件可以提高相關酶活性，從而影響到GABA支路，從而提高了甜蕎萌發過程中產生GABA的能力。

地球自身存在一定的電場，以大氣層為零電勢，地面平均電場強度為-130 V/m。地球的電場本身對生物的生長代謝有著一定影響。國內外幾乎沒有關于使用高壓電場處理甜蕎促進其萌發后GABA積累的研究，但是多項研究表明，外加高壓電場處理會影響到植物種子的萌發、生長等[6]。徐佳楠等發現通過高壓電場處理可以促進菠菜新、陳種子萌發，并得到低場強處理效果不明顯、過高場強處理抑制菠菜種子萌發的結論[7]。高壓電場可以通過改變酶的高級結構，影響酶活性的高低，進一步影響到植物的生理代謝[8]，王莘等使用高壓電場對月見草進行處理，結果表明電場處理使過氧化物酶同工酶活性增強，對生物膜保護作用增強，并且可以促進新蛋白合成和胚發育[9]。胡建芳等通過高壓電場處理高粱種子，結果表明適宜的電場處理可以提高高粱種子內α-淀粉酶、SOD、POD的活性[10]。

在國內，甜蕎主要是制粉后作為原料制作面條、小吃等，而且有了方便蕎麥面條、碗團等可工廠化生產的產品，但是這類產品特點在于方便，在營養及功能性方面有著極大的提升空間。甜蕎經短期萌發后便于制粉且營養性得到提高，通過試驗中方法處理甜蕎使得其 GABA含量得到提升，以處理后的甜蕎為原料制得的產品在不影響原產品口感、外形等品質的前提下具有更高的營養價值，可產生更多的經濟效益，而且符合現代人的飲食理念。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜蕎：內蒙古赤峰；GABA標準品：北京索萊寶科技有限公司；四硼酸鈉（分析純）：天津市北辰方正試劑廠；次氯酸鈉溶液（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；重蒸苯酚（分析純）：上海藍季科技有限公司；無水乙醇（分析純）：北京華騰化工有限公司；植物谷氨酸脫羧酶（GAD）ELISA試劑盒：江蘇晶美生物科技有限公司；植物GABA轉氨酶（GABA-T）ELISA試劑盒、植物琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）ELISA試劑盒：江蘇酶免實業有限公司。

1.2 儀器與設備

高壓直流電源（0 V～-30 KV）：天津市東文高壓電源廠；LDZ5-2型低速自動平衡離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；P4型分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；LRHS-250-Ⅱ型恒溫恒濕培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；多功能粉碎機：北京科偉永興儀器有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；424R型冷凍離心機：德國 eppendorf公司；SpectraMax iD5-多功能酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甜蕎處理方式及指標測定

挑選顆粒完整、大小均勻的甜蕎籽粒，之后清水淘洗，并加入約甜蕎籽粒二倍體積的自來水，并在預先設置的符合試驗條件的溫度下浸泡數小時。甜蕎籽粒經浸泡后吸水膨脹，更利于萌發。將浸泡過后的甜蕎籽粒用清水沖洗，洗去表面粘液與浮沫。沖洗過的甜蕎籽粒平鋪于塑料托盤并覆蓋上濕紗布以保證萌發過程中的水分。將盛有試驗樣品的托盤放置于設好溫度與濕度的恒溫恒濕培養箱中，設置溫度為 25 ℃，濕度為 80%。培養0、8、16、24、32、40 h后取出甜蕎樣品放置于-80 ℃冰箱待測。需干燥的樣品利用真空冷凍干燥機凍干，之后使用多功能粉碎機粉碎，粉碎時間為1 min，待粉碎機冷卻徹底后進行下一批樣品粉碎，樣品粉末過80目篩。得到的樣品粉末用塑封袋密封、避光保存，以待測定。

GABA易溶于水，微溶于乙醇等有機溶劑，可利用蒸餾水對樣品粉末中的GABA進行提取。稱取3 g樣品粉末，加水混勻后定容至30 mL。將制得的樣品混合溶液用蒸餾水在 35 ℃的條件下超聲波震蕩提取 30 min，之后利用離心機在5 000 r/min的條件下離心20 min，取甜蕎樣品提取液上清液備測。GABA與常規氨基酸在Berthelot反應中的響應差別巨大，利用Berthelot反應進行測定[11]。取300 μL甜蕎樣品提取液，加入0.1 mol/L四硼酸氫鈉緩沖液200 μL，6%重蒸苯酚400 μL，7.5%次氯酸鈉 600 μL。沸水浴 10 min，后冰浴5 min，期間不斷搖晃，最后加入60%乙醇2 mL。在波長645 nm處測量吸光度。

酶活性利用酶聯免疫試劑盒中相應方法測定。

1.3.2 高壓電場搭建及處理方式

試驗中采用的高壓電場由實驗室自行搭建。高壓電場的電極板使用表明平整光潔的不銹鋼板并涂抹不銹鋼漆制成，極板長1.5 m、寬0.8 m，將極板平行放置于木質的多層結構。將其中一片極板與高壓直流電源相接，其臨近的極板與地線相接，當電源接通后兩極板間形成一個高壓電場。高壓電場運行工作時產生的高壓會對空氣有電離作用，并會產生臭氧，故高壓電場的工作環境要干燥且通風良好。

經浸泡處理后的甜蕎籽粒需及時進行高壓電場處理，將浸泡吸漲后的甜蕎籽粒平鋪于托盤并覆蓋濕潤的紗布保證其濕度，托盤放置于電場的電極板之間，且盡量放于極板中間位置，減少邊界效應的影響。之后接通電源，調整合適的輸出電壓，處理一段時間后關閉電源，將處理后的甜蕎轉入合適的培養環境。

1.4 數據分析

試驗重復 3次，數據處理使用 IBM SPSS Statistics 23.0軟件。

2 結果與分析

2.1 高壓電場處理對甜蕎萌發后 GABA含量的影響

2.1.1 電場強度和方向對GABA含量的影響

甜蕎籽粒在35 ℃條件下浸泡3 h，甜蕎籽粒為菱形，模擬實際生產，浸泡后的甜蕎自由散落后側躺于平面，電場方向垂直于地面。使用電場強度為 0，0.5，1.0，1.5 KV/cm 及-0.5，-1.0，-1.5 KV/cm的高壓電場分別處理30 min，經電場處理后的甜蕎在溫度25 ℃，濕度80%的條件下培養24 h，以電場強度0 KV/cm處理組為空白對照組。試驗結果如圖1所示。在相同電場強度下不同場強方向處理后的甜蕎中GABA含量差異不顯著（P＜0.05）。對照組GABA含量（171.68±0.45） mg/100 g，場強0.5 KV/cm處理組GABA含量（181.82±1.37） mg/100 g，場強1.0 KV/cm處理組GABA含量（190.18±1.37） mg/100 g，1.5 KV/cm 處理組 GABA 含量（192.12±0.52）mg/100 g。電場處理組與空白對照組相比GABA含量差異顯著（P＜0.05）；場強0.5 KV/cm處理組與場強1.0 KV/cm處理組差異顯著（P＜0.05）；場強1.0 KV/cm處理組與場強1.5 KV/cm處理組差異不顯著（P＜0.05）。試驗結果表明：外加高壓電場可以顯著提高甜蕎萌發過程中產生 GABA的能力。在一定電場強度范圍內，隨著場強的增加，甜蕎萌發后GABA含量越高，但是當外加電場強度到達一定程度時（1.0 KV/cm～1.5 KV/cm）GABA的含量無顯著提升；試驗還表明電場方向對自由散落后側臥的甜蕎萌發過程中產生GABA的含量無顯著影響。

圖1 電場強度對萌發后甜蕎中GABA含量的影響Fig. 1 Effect of electric field intensity on GABA content in buckwheat after germination

2.1.2 電場處理時間對GABA含量的影響

甜蕎浸泡后在1.0 KV/cm的電場中處理不同時間，試驗結果如圖2所示。在30～60 min處理組間甜蕎中 GABA含量差異不顯著（P<0.05）；15 min處理組與 60 min處理組差異顯著（P<0.05）。高壓電場處理時間30 min以上時，外加高壓電場處理的時間對甜蕎中GABA的含量無顯著影響。試驗結果表明：甜蕎經 1.0 KV/cm的電場處理30 min以上，其GABA含量得到顯著提升。

圖2 電場處理時間對萌發后甜蕎中GABA含量的影響Fig. 2 Effect of electric field treatment time on GABA contentin buckwheat after germination

2.1.3 電場處理后甜蕎萌發40 h內GABA含量的變化

由試驗2.1.1、2.1.2可知使用1.0 KV/cm高壓電場處理30 min，在節能的同時也能夠對甜蕎中GABA的富集達到最優效果。在該條件下對浸泡后的蕎麥處理，同時設置未經高壓電場處理的甜蕎為對照組，每隔8 h取樣一次，測定其40 h內GABA含量變化，結果如圖3所示。甜蕎在萌發40 h內其 GABA含量呈現出先上升后下降的趨勢，且在24 h含量達到最高，此時未處理組甜蕎GABA含量為（184.38±0.46） mg/100 g，電場處理組中甜蕎 GABA 含量達到（195.49±0.81）mg/100 g。在甜蕎萌發16 h后，甜蕎中GABA含量顯著提高（P＜0.05），高壓電場處理組中GABA含量顯著高于對照組（P＜0.05）。甜蕎萌發 24 h后GABA含量開始降低。

圖3 電場處理后甜蕎萌發40 h內GABA含量的變化Fig. 3 Changes of GABA content in buckwheat after electric field treatment within 40 h of germination

2.2 電場處理對甜蕎 GABA合成相關酶類活性的影響

2.2.1 電場處理對甜蕎萌發過程中 GAD活性的影響

GAD可以促進甜蕎萌發過程中 GABA的合成。使用1.0 KV/cm高壓電場處理甜蕎30 min，并對其萌發40 h內GAD活性進行測定，結果如圖4所示。經高壓電場處理后的甜蕎萌發40 h內GAD 活性整體高于未處理組（P＜0.05）；甜蕎在浸泡后GAD有著較高活性，萌發初期GAD活性降低，之后不斷提高，在萌發24～32 h期間GAD活性較高，32 h后GAD活性降低。高壓電場處理對甜蕎中GAD活性影響主要表現在萌發初期，經處理后甜蕎在萌發初期 GAD活性要明顯高于對照組；萌發40 h內甜蕎中GAD活性也與甜蕎中GABA的含量表現出相關性。

圖4 電場處理對甜蕎萌發過程中GAD活性影響Fig. 4 Effect of electric field treatment on GAD activity during germination of buckwheat

2.2.2 電場處理對甜蕎萌發過程中GABA-T活性的影響

GABA-T促進甜蕎中 GABA分解轉化為SSA。使用1.0 KV/cm高壓電場處理甜蕎30 min，并對其萌發40 h內GABA-T活性進行測定，結果如圖5所示。對于高壓電場處理組，萌發0～16 h期間，處理組甜蕎中的GABA-T活性要顯著高于對照組（P＜0.05），但是未對該階段甜蕎萌發過程中GABA的整體積累有降低作用，推測其活性變高是由于電場處理提高了萌發初期 GAD活性并促進GABA的積累，大量GABA的產生刺激了相關代謝而促進了GABA-T活性的提高；在萌發16 h后GABA-T活性急劇降低，并且在萌發24～40 h期間處理組中 GABA-T活性要顯著低于對照組（P＜0.05），這利于甜蕎萌發中后期 GABA 的積累。對照組中GABA-T活性呈現出較為規律的先上升后降低的趨勢。

圖5 電場處理對甜蕎萌發過程中GABA-T活性影響Fig. 5 Effect of electric field treatment on GABA-T activity during germination of buckwheat

2.2.3 電場處理對甜蕎萌發過程中 SSADH活性的影響

SSADH是參與 GABA代謝支路最后環節的酶。使用1.0 KV/cm高壓電場處理甜蕎30 min，并對其萌發40 h內SSADH活性進行測定，結果如圖6所示。高壓電場處理組甜蕎中SSADH活性整體低于對照組。在處理組中，8～16 h期間SSADH活性明顯提高，推測是由于在該階段GABA-T活性較高，大量生成的SSA使得SSADH活性提高來將 SSA轉化為琥珀酸，之后隨著GABA-T活性降低，SSA合成減少，SSADH活性降低；對照組中GABA-T在24～40 h期間保持較高活性，在此期間 SSADH活性要顯著高于處理組（P＜0.05）。

圖6 電場處理對甜蕎萌發過程中SSADH活性影響Fig. 6 Effect of electric field treatment on SSADH activity during buckwheat germination

2.3 分析討論

多項研究表明，外加高壓電場處理可以影響到植物細胞結構，促進植物細胞受損結構修復、增加細胞活性。外加高壓電場可以改變酶的高級結構，進一步影響到其活性。水分子團處于一種大分子團解締為小分子團，小分子團締結為大分子團的過程，高壓電場極有可能打破這一平衡，活化了水分子團，水作為生物體內各種反應的介質，其性質的改變會影響到相關酶促反應的速率。此外，高壓電場會使水中產生過量超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可以增加植物細胞膜通透性，除了增加籽粒對外界水、無機鹽、氧、氮等的吸收，還可以激活部分相關酶系的調控基因，加速種子萌發代謝[9]。本試驗中，外加高壓電場處理組與未處理組相比，甜蕎經萌發后GABA的含量顯著提升，證明合適條件的高壓電場處理可以提高甜蕎萌發過程中產生GABA的能力。試驗中高壓電場對GABA代謝支路中的多種酶類產生影響，促進了甜蕎萌發過程GABA的積累。郝建雄等的研究表明甜蕎在萌發2 d以內其GAD活性較高，之后 GAD活性下降明顯[12]。部分研究表明通過 Ca2+或 H2O2等化學試劑脅迫及真空處理也可以促進谷物中GABA或是其他營養成分的積累[13-14]。

3 結論

甜蕎萌發后GABA含量隨著電場處理時電場強度增加得到提升，但在場強到達一定強度（1.0～1.5 KV/cm）后無法繼續提高，且電場方向對自由散落后側躺狀態的甜蕎中GABA含量無顯著影響（P＜0.05）；電場處理處理30～60 min間甜蕎 GABA 含量無顯著差異（P＜0.05）。由試驗可得處理甜蕎的最佳條件為使用1.0 KV/cm高壓處理30 min。甜蕎浸泡處理后外加場強1.0 KV/cm的高壓電場處理30 min，之后在溫度25 ℃，濕度80%條件下萌發24 h。經該方式處理后甜蕎中GABA含量達到（195.49±0.81） mg/100 g，對照組中甜蕎GABA含量達到（184.38±0.46） mg/100 g，差異顯著（P＜0.05）。

高壓電場處理會影響到甜蕎GABA代謝支路中酶的活性。電場處理后甜蕎萌發過程中 GAD的活性得到提高；GABA-T活性萌發前期得到提升，中后期顯著降低；電場處理對 SSADH活性整體表現出抑制作用。萌發過程中甜蕎GABA含量與GAD活性表現出一定的相關性，證實GAD是影響甜蕎萌發過程中GABA積累的主要酶類，同時也表明高壓電場通過影響GABA支路相關酶類活性來達到對甜蕎萌發過程中GABA的富集。