長鏈非編碼RNA ELFN1-AS1在結直腸癌患者血清中的表達及臨床意義*

董利陽，徐小衛，鄭婷婷，劉佳夢，毛朝明

江蘇大學附屬醫院核醫學科，江蘇鎮江 212002

2018年全球腫瘤流行病學調查顯示，結直腸癌的發病率在全球惡性腫瘤中排第3位，在腫瘤病死率中排第2位[1]。研究表明，結直腸癌患者的生存率與疾病分期明顯相關，Ⅰ～Ⅱ期患者的整體生存率約為90%，Ⅲ期約為71%，Ⅳ期約為14%[2]。顯然，早期發現對提高結直腸癌患者的整體生存率具有重要的臨床意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種長度大于200 nt且蛋白質編碼能力有限的RNA。研究發現，lncRNA在多種類型的腫瘤組織中表達異常，且影響腫瘤的發生、癌變和轉移[3]。lncRNA亦在血液樣品中穩定表達，顯示出作為新型腫瘤標志物的潛能，而將循環lncRNA作為癌癥診斷的標志物已在肺癌、肝癌、乳腺癌中被報道[4]。lncRNA ELFN1-AS1是一種新近發現的lncRNA，位于ELFN1基因的反義位置[5]。GEPIA數據庫分析發現，結直腸癌患者結腸病灶中lncRNA ELFN1-AS1高表達，并與患者總生存率降低密切相關[6]。筆者先前對22例結直腸癌患者結腸和其鄰近組織中lncRNA ELFN1-AS1測定時發現，lncRNA ELFN1-AS1水平在結直腸癌組織中明顯升高。體外細胞實驗發現，ELNF1-AS1的敲除明顯抑制了結直腸癌細胞株的生長和遷移，提示lncRNA ELFN1-AS1失調在結直腸癌發展中發揮關鍵作用[7]。本研究旨在探究lncRNA ELFN1-AS1在結直腸癌患者血清中的表達及臨床意義，以期為結直腸癌的早期診斷提供新策略。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年9月至2021年2月于本院胃腸外科和腫瘤科診治的結直腸癌患者50例作為結直腸癌組。納入標準：(1)病理學檢查明確診斷；(2)為初次診治，無放療、化療及靶向抗癌治療史。排除標準：(1)合并其他腫瘤；(2)既往有結直腸腫瘤史，并接受抗腫瘤治療；(3)患有精神疾病或存在嚴重的心、肝、肺等其他重要臟器疾病。收集同期本院體檢健康者40例作為對照組。結直腸癌組男30例，女20例；年齡<60歲患者17例，≥60歲33例。對照組男25例，女15例；年齡<60歲13例，≥60歲27例。結直腸癌組和對照組性別、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究通過本院醫學倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2儀器與試劑 MolPure?Blood RNA提取試劑盒(上海YEASEN公司)，lncRNA ELFN1-AS1及18S real-time PCR引物(廣州復能基因公司)，All-in-one First-Strand cDNA Synthesis反轉錄試劑盒及All-in-oneTMqPCR Mix實時熒光定量試劑盒(廣州復能基因公司)，NnoDrop ONE微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)，普通PCR儀(美國Bio-Rad公司)，QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集所有研究對象的空腹靜脈血5 mL(結直腸癌患者于手術前采集，體檢健康者于體檢時采集)，置于含促凝膠的真空采血管中，2 000 r/min離心10 min，吸取上層血清置于無RNAse的1.5 mL EP管中并于-80 ℃冰箱保存備用。同時獲取結直腸癌患者臨床資料用于分析。

1.3.2血清總RNA的提取 按照MolPure?Blood RNA試劑盒說明書提取血清總RNA，簡化步驟如下：血清樣品用裂解液LB充分裂解后加入氯仿，混勻后12 000 r/min離心，取上層水相并加入無水乙醇(混合液)，將混合液置于RNA吸附柱并離心，經過去蛋白液及漂洗液洗滌后收集RNA。應用NnoDrop ONE測定RNA濃度及純度。

1.3.3反轉錄 按照反轉錄試劑盒說明書將獲取的合格RNA反轉錄為cDNA，反應條件為37 ℃ 60 min， 85 ℃ 5 min，用DEPC水2倍稀釋cDNA后置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.4實時熒光定量PCR 熒光定量PCR總反應體系為20 μL，包括2 μmol/L上、下游引物各2 μL，2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL。循環參數：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 15 s(采集熒光信號)，共40個循環。lncRNA ELFN1-AS1：正向引物5′- CCT GAT GTT CTG CTT GGT TAT-3′，反向引物5′-ACA CAG CTC CTG CTC TTG-3′；18S(內參基因)：正向引物5′-ACA GGA TTG ACA GAT TGA-3′，反向引物5′-TAT CGG AAT TAA CCA GAC A-3′。使用QuantStudio Design Software v1.4.3進行熔解曲線分析，評測PCR產物的特異度。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA ELFN1-AS1的相對表達水平，公式為ΔΔCt=結直腸癌(Ct目的-Ct內參)-健康對照(Ct目的-Ct內參)。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行統計分析。數據為非正態分布，以M(P25,P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線評價lncRNA ELFN1-AS1對結直腸癌的診斷價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1結直腸癌組與對照組血清lncRNA ELFN1-AS1檢測結果 結直腸癌組血清lncRNA ELFN1-AS1的相對表達水平[2.291(1.23,4.55)]明顯高于對照組[0.46(0.13,1.27)](Z=-5.209,P<0.001)，見圖1。

圖1 血清lncRNA ELFN1-AS1在對照組與結直腸癌組中的相對表達水平

2.2血清lncRNA ELFN1-AS1相對表達水平與結直腸癌患者臨床病理參數關系 將血清lncRNA ELFN1-AS1相對表達水平與結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移狀態、TNM分期進行分析，結果發現血清lncRNA ELFN1-AS1相對表達水平在不同淋巴結轉移、遠處轉移狀態及TNM分期患者之間差異有統計學意義(P<0.05)，而在不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑患者之間差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 血清lncRNA ELFN1-AS1相對表達水平與結直腸癌患者臨床病理參數的關系[M(P25,P75)]

2.3血清lncRNA ELFN1-AS1檢測對結直腸癌的診斷價值 繪制ROC曲線評估lncRNA ELFN1-AS1對結直腸癌的診斷效能，結果表明lncRNA ELFN1-AS1的ROC曲線下面積(AUC)為0.821(95%CI：0.734～0.908)，當最佳截斷值為1.465時，其診斷結直腸癌的靈敏度為74.0%，特異度為82.5%，見圖2。

圖2 血清lncRNA ELFN1-AS1診斷結直腸癌的

3 討 論

近年來，lncRNA被報道參與了結直腸癌的發生過程[8]。研究表明，lncRNA ELFN1-AS1不僅參與結直腸癌的發生，且在細胞遷移及腫瘤侵襲中發揮重要作用。LEI等[9]發現,lncRNA ELFN1-AS1在結直腸癌腫瘤組織中的表達水平明顯高于鄰近癌旁正常組織，lncRNA ELFN1-AS1表達水平較高的患者生存率明顯降低。DU等[10]發現，lncRNA ELFN1-AS1可以海綿樣吸附miR-191-5p，從而釋放特殊AT豐富序列結合蛋白1(SATB1)的促癌作用促進結直腸癌的生長及轉移。筆者前期發現，lncRNA ELFN1-AS1通過激活Erk及EMT信號通路，促使結直腸癌細胞的增殖和遷移[7]。本研究結果提示，結直腸癌組血清中可穩定表達lncRNA ELFN1-AS1，且其相對表達水平明顯高于對照組，血清中lncRNA ELFN1-AS1相對表達水平在不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑患者之間差異無統計學意義(P>0.05)，但在不同臨床TNM分期、不同淋巴結轉移和遠處轉移狀態患者之間差異有統計學意義(P<0.05)，提示lncRNA ELFN1-AS1可能成為診斷結直腸癌的生物學標志。

癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫分析發現，結直腸組織(結直腸癌227例，正常對照26例)中lncRNA ELFN1-AS1的表達具有診斷結直腸癌的潛在價值,其診斷結直腸癌的靈敏度為87.6%，特異度為100.0%[11]。本研究結果顯示，血清lncRNA ELFN1-AS1診斷結直腸癌的AUC為0.821，當最佳截斷值取1.465時，靈敏度和特異度分別是74.0%、82.5%，進一步表明lncRNA ELFN1-AS1對診斷結直腸癌的重要價值。鑒于血清學的取材方便、無創性的特點，血清lncRNA ELFN1-AS1在結直腸癌篩查中可能更具明顯優勢。

lncRNA ELFN1-AS1表達水平在結直腸癌患者血清中明顯升高，其表達水平與腫瘤轉移和TNM分期有關，有望成為結直腸癌診斷的重要指標之一。但由于本研究樣本量較小，仍需要進行大規模多中心臨床研究來驗證其有效性。