石家莊市苯丙氨酸羥化酶缺乏癥的基因突變研究*

馬翠霞，封露露，李麗欣，白 雪，馬倩倩，封紀珍△

1.石家莊市婦幼保健院遺傳科，河北石家莊 050000；2.石家莊市婦產醫院體檢中心，河北石家莊 050000

正常情況下，天然食物中的蛋白質分解產生的苯丙氨酸(Phe)在肝臟苯丙氨酸羥化酶(PAH)的作用下轉化成酪氨酸，PAH缺乏的患兒可導致高苯丙氨酸血癥(HPA)，Phe旁路代謝增強，使得大量苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸從尿中排出，血中增多的Phe可以通過血腦屏障，導致腦內Phe水平增高，引起腦髓鞘發育不良或脫髓鞘等腦白質異常，進而導致神經系統損傷[1]。近些年，雖然隨著測序技術的發展，研究者很容易在苯丙酮尿癥(PKU)早期患兒中獲得準確的分子遺傳學診斷結果，但PAH基因變異在不同地區人群中分布不同，代謝表型也存在較大差異，而患兒的基因型又是臨床表型的主要決定因素。因此，本研究旨在探討石家莊新生兒疾病篩查診治中心確診的苯丙氨酸羥化酶缺乏癥(PAHD)患兒PAH基因突變的規律及特點，為深入開展PAHD的診斷及產前診斷、治療和遺傳咨詢提供科學的參考依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年5月至2020年7月在石家莊市新生兒疾病篩查診治中心確診的67例PAHD患兒作為研究對象，排除BH4缺乏癥及暫時性HPA患兒。其中男37例，女30例；經典型PKU(cPKU)16例，輕度PKU(mPKU)11例，輕度HPA(MHP)40例。本研究經醫院醫學倫理學委員會批準，所有檢查均獲得患兒家長或監護人的知情同意，并與監護人簽署知情同意書。

1.2診斷標準 根據2014年發表的《高苯丙氨酸血癥的診治共識》[2]，Phe>120 μmol/L(2 mg/dL)及血Phe與酪氨酸(Tyr)比值(Phe/Tyr)>2.0統稱為HPA。其中血Phe≥1 200 μmol/L為cPKU；360 μmol/L≤血Phe<1 200 μmol/L為mPKU；120 μmol/L<血Phe<360 μmol/L為MHP。

1.3研究方法 抽取PAHD患兒及父母外周靜脈血各4 mL，采血管為2%乙二胺四乙酸二鈉抗凝，按照基因組DNA提取試劑盒說明書對所取標本進行核酸提取，使用 Nanodrop2000超微量分光光度計對DNA進行質檢，檢測合格后進行基因組文庫構建。用生物素標記的探針與文庫DNA進行雜交，用鏈霉親合素修飾的磁珠共價結合生物素標記的探針抓取目的基因，磁力架吸附攜帶目的基因的磁珠，洗脫純化，富集目的基因。采用NextSeq500高通量測序儀測序。所有數據應用SOAP SNP程序進行單核苷酸序列多態分析，對于檢測到的突變位點嚴格按照ACMG指南[3]進行致病性分析。對于未報道突變位點，使用生物信息學蛋白功能綜合性預測軟件REVEL、SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster、GERP+對致病性進行預測。對發現的致病突變在其所在片段上、下游設計引物進行PCR擴增及Sanger測序，從而驗證高通量測序的結果，對患兒父母采用Sanger法進行目標基因突變驗證。以上基因檢測由北京邁基諾醫學檢驗所完成。

2 結 果

2.1PAH基因突變在PAHD患兒中的分布 在67例PAHD患兒的134個PAH等位基因中共檢測到134個突變基因位點，61例患兒的PAH基因檢測到2個突變位點，其中2例患兒PAH基因為純合突變，所攜帶的突變基因分別為c.331C>T/c.331C>T和c.721C>T/c.721C>T，純合突變率為2.99%(2/67)，59例患兒PAH基因突變為復合雜合突變。3例患兒PAH基因檢測到3個突變位點，所攜帶的突變基因分別為c.158G>A/c.842+2T>A/c.898G>T、c.158G>A/c.842+2T>A/c.1123C>G和c.158G>A/c.158G>A/c.842+2T>A。3例患兒PAH基因檢測到1個突變位點。

2.2PAHD患兒PAH基因突變類型及特點 67例PAHD患兒PAH基因序列測定分析結果顯示，在134條染色體中總計發現44種突變，134個突變位點,突變位點均經一代測序驗證。主要包括錯義突變27種(61.36%)，剪接突變8種(18.18%)，無義突變6種(13.64%)，移碼突變兩種(4.55%)，同義突變1種(2.27%)。134個突變位點分布在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12外顯子及第1、4、5、7、8、10、12內含子，其中第2外顯子檢測到的突變最多，占21.64%(29/134)；其他位置的突變頻率由高到低依次為第7外顯子(15.67%,21/134),第3外顯子(11.19%,15/134),第11外顯子(10.45%，14/134)，第6外顯子(9.70%，13/134)，第12外顯子(9.70%，13/134)。PAH基因突變位點主要有p.R53H(突變頻率為20.90%，28/134)，p.R243Q(突變頻率為7.46%，10/134)，p.R111X(突變頻率為6.72%，9/134)，p.Y204C(突變頻率為6.72%，9/134)，c.442-1G>A(突變頻率為5.22%，7/134)，p.Y356X(突變頻率為3.73%、5/134)，p.R413P(突變頻率為3.73%、5/134)，具體突變位點情況見圖1。

注：*標注的基因突變位點為本研究中發現的未見報道基因突變位點。

2.3cPKU、mPKU及MHP患兒PAH基因突變位點 石家莊市PAHD患兒基因突變以復合雜合突變為主，在各型患兒中PAH基因高頻突變位點有所不同。16例cPKU患兒中共檢測到突變12種，其中c.1068C>A和c.331C>T突變頻率最高，均為15.63%(5/32)，其次為c.728G>A，突變頻率為12.50%(4/32)；純合突變頻率為6.25%(1/16)，其余均為復合雜合突變。

11例mPKU患兒中共檢測到突變12種，其中c.721C>T突變頻率最高，為18.18%(4/22)，其次為c.1252A>C，突變頻率為13.64%(3/22)；純合突變頻率為9.09%(1/11),其余均為復合雜合突變。

40例MHP患兒中共檢測到突變33種，其中c.158G>A突變頻率最高，為35.00%(28/80),其次為c.611A>G和c.728G>A，突變頻率均為6.26%(5/80),均為復合雜合突變，具體情況見表1。

表1 67例PAHD患兒PAH基因突變檢測結果

續表1 67例PAHD患兒PAH基因突變檢測結果

2.4未報道的PAH基因 在石家莊市新生兒疾病篩查診治中心確診的67例PAHD患兒中發現134個PAH基因突變位點，其中有3個突變位點未見報道，分別為c.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G，對患兒及其父母進行Sanger測序驗證，排除多態性位點可能性，測序結果見圖2、3、4。

注：A、B、C分別為PAHD患兒及其父母測序結果，箭頭所示為基因突變位置。

注：A、B、C分別為PAHD患兒及其父母測序結果，箭頭所示為基因突變位置。

注：A、B、C分別為PAHD患兒及其父母測序結果，箭頭所示為基因突變位置。

3 討 論

PAH基因突變是導致PKU發病的重要原因之一，PAH活性受損或喪失，使得血液中的Phe無法完全代謝，在體內大量蓄積，進一步導致HPA，影響患兒機體和大腦的發育。HPA為常染色體隱性遺傳病，是少數可以治療的遺傳代謝病之一。如果通過篩查能夠在早期對HPA進行及時確診和治療，多數是可以避免其對患兒神經系統造成不可逆損傷的情況。本研究通過對PAHD患兒基因檢測結果進行分析總結，不僅補充、完善了石家莊市PAHD患兒的基因突變圖譜，并且為PAHD患兒家庭的遺傳咨詢提供了有價值的信息。

任何一種突變都有可能導致PAH基因結構的改變，從而導致PAH活性的改變，影響Phe的代謝過程。有學者報道，在中國人群中已鑒定出的PAH基因突變有100余種[4]，PAH基因突變在不同地區及人群中分布有所不同，代謝表型也存在較大差異，有研究表明，我國華南地區PAHD的發生率明顯低于華北地區，中部和西部地區高于東部地區[5-6]。構建每個地區的 PAH基因突變譜有助于研究基因變異與表型的關系,更好地服務于臨床，因此，完善中國不同地區 PAH基因突變譜的構成具有重要意義。本研究中61例患兒PAH基因突變為2個突變位點，其中2例PAH基因為純合突變基因，所攜帶的突變基因分別為c.331C>T/c.331C>T和c.721C>T/c.721C>T； 59例患兒PAH基因突變為復合雜合突變。3例患兒PAH基因突變為3個突變位點，所攜帶的突變基因分別為c.158G>A/c.842+2T>A/c.898G>T、c.158G>A/c.842+2T>A/c.1123C>G和c.158G>A/c.158G>A/c.842+2T>A。3例患兒PAH基因檢測到1個突變位點。

PAH基因突變的形式涵蓋錯義突變、剪接突變、無義突變、移碼突變、同義突變等，石家莊市PAH基因突變類型與之前報道的基本一致[7]，主要有錯義突變(61.36%)、剪接突變(18.18%)、無義突變(13.64%)等，PAH基因在所有位置都有可能發生基因突變，大多數突變集中在外顯子上[8]。PAH基因突變具有高度遺傳異質性，突變種類繁多且分布不均，每種突變在不同地區和人群中的發生率存在很大差異，但某些突變位點在某些地區又存在一致性。

石家莊市PAHD患兒基因突變位點主要分布在第2、3、6、7、11和12外顯子，這與之前報道的中國和亞洲人群突變情況是一致的[9-11]。然而在不同區域及人群中又存在一定的差異，第2外顯子檢測到的突變最多，這與文獻[9-11]報道的情況又有所不同。

本研究67例PAHD患兒中，54.48%的突變是由7個突變位點引起。最常見的基因突變位點有p.R53H(突變頻率為20.90%)、p.R243Q(突變頻率為7.46%)、p.R111X(突變頻率為6.72%)、p.Y204C(突變頻率為6.72%)、c.442-1G>A(突變頻率為5.22%)、p.Y356X(突變頻率為3.73%)、p.R413P(突變頻率為3.73%)。本研究結果發現，石家莊市PAH基因常見突變位點排除了中國南方地區常見的p.R241C和p.R408Q突變[12]。

基因型與臨床表型之間具有一定的相關性，PAH基因突變位點的相關研究對指導臨床治療具有重要意義，然而帶有相同PAH基因突變的不同PAHD患兒間也存在一定的表型差異，因此，筆者通過分析PAHD患兒的基因突變類型與臨床表型之間的關系，可為患兒提供個體化的治療方案，并且能夠更好地為患兒的家庭提供遺傳咨詢和產前診斷的幫助。

石家莊市PAHD患兒基因突變以復合雜合突變為主，其中突變頻率較高的突變位點有：c.158G>A、c.728G>A、c.331C>T和c.611A>G、c.442-1G>A，提示石家莊市在開展PAHD產前基因診斷或進行相關基因突變研究時，需要重點關注上述突變位點，這與國內其他報道既有相似性也有差異性。石家莊市c.158G>A突變頻率最高，與青島市[13]、海南省[14]、安徽地區[15]PAHD患兒的PAH基因突變的特征一致，而該突變位點在云南地區[16]、青海地區[17]、寧夏地區[18]、陜西省[19]、浙江省[12]、內蒙古地區[20]等卻不是高頻突變位點。c.1068C>A在青島市[21]突變頻率較高，而在石家莊市較低。

PAH基因突變位點c.728G>A、c.331C>T和c.442-1G>A與報道中我國北方群體[22]中PAH基因突變情況一致，但c.611A>G不是該報道中北方群體PAH基因突變頻率較高的突變位點，但此突變位點在石家莊市突變頻率較高。報道中南方群體[22]中PAH基因的突變位點c.1223G>A(p.R408Q)和c.498C>G(p.Y166X)在石家莊市也不是突變頻率較高的突變位點。本研究探討了石家莊市PAHD患兒的基因突變特點，然而在PAHD各型患兒中突變位點卻有所不同，cPKU患兒以c.1068C>A、c.331C>T為主，mPKU患兒以c.721C>T、c.1252A>C為主，MHP患兒以c.158G>A為主。在突變位點中c.1068C>A僅在5例cPKU患兒中檢出，推測c.1068C>A可能是石家莊市cPKU中PAH基因的高頻突變位點；c.331C>T、c.442-1G>A、c.611A>G、c.728G>A、c.1197A>T在各型患兒中均有檢出；c.721C>T僅在3例mPKU患兒(1例為純合突變)中檢出，推測c.721C>T可能是石家莊市mPKU中PAH基因的高頻突變位點；c.158G>A僅在27例MHP患兒(1例為純合突變)中檢出，推測c.158G>A可能是石家莊市MHP中PAH基因的高頻突變位點。值得注意的是，c.158G>A在中國北方的mPKU和MHP患者中的突變頻率似乎高于其他地區，這可能代表著某些人群的擴張或遷移[22-23]。

PAH基因突變對酶活性的影響主要依賴于突變的位置和形式，本研究發現未報道的3種PAH基因突變位點c.912+5G>T、c.61-1G>A和c.630T>G，分別位于外顯子8、外顯子2和外顯子6。c.912+5G>T在健康人群數據庫中為低頻變異，根據ACMG指南[3]該變異初步判定為臨床意義未明。c.630T>G位于基因的非保守區，在健康人群數據庫中為低頻變異，根據ACMG指南[3]該變異初步判定為臨床意義未明,使用生物信息學蛋白功能綜合性預測軟件REVEL、SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster、GERP+預測結果分別為有害、良性、有害、有害、良性。c.61-1G>A位于基因的保守區，在健康人群數據庫中為低頻變異，根據ACMG指南[3]該變異初步判定為疑似致病性變異。這3個位點突變形式為剪接突變和錯義突變，這可能會導致酶蛋白表達異常，進而影響蛋白質的折疊及穩定性，從而影響酶蛋白的催化活性。這些變化與PAHD的關系亟待進一步證實。其中發生c.912+5G>T突變的患兒為mPKU，發生c.61-1G>A和c.630T>G突變的患兒為MHP，這3個PAH基因突變位點在石家莊市mPKU和MHP患兒中檢出，提示在進行mPKU和MHP患兒的確診工作時應尤其注意這些突變位點的總結和分析，為以后石家莊市mPKU和MHP患兒PAH基因的突變類型、特點積累數據。

目前，中國已報道的PAH基因突變類型約有190余種，且大多為雜合變異類型。本研究通過分析石家莊市PAHD患兒PAH基因的突變類型、特點及與臨床表型間的聯系，不僅為產前診斷、遺傳咨詢提供了理論依據，而且對降低PAHD的發病率，提高人口素質具有重要意義。但本研究目前的數據量尚比較少，需要進一步增加標本數據進行綜合分析。