基于質譜技術對森林腦炎患者血清代謝組學的研究*

王曉艷，李 翔，肖 翔，陸德生，張仕華，杜彥丹

內蒙古林業總醫院/內蒙古民族大學第二臨床醫學院，內蒙古呼倫貝爾 021000

森林腦炎是一種由蜱傳森林腦炎病毒引起的發熱性疾病，嚴重時會對中樞神經造成一定程度損傷[1]。森林腦炎主要流行于歐洲及亞洲東北部林區，近年來隨著生態旅游業的發展，感染人群范圍持續擴大，嚴重影響人民健康及經濟發展[2]。森林腦炎是一種自抑性疾病，機體主要憑借自身抗炎作用進行自我修復，目前仍無特效治愈方式[1,3]，且病毒入侵機體產生的促炎及抗炎作用機制還未被揭示。代謝組學憑借高通量技術和先進的數據分析方法，捕捉生物體內代謝通路變化，從而系統揭示機體的整個代謝變化，在系統科學中占據舉足輕重的位置[4-7]。筆者前期基于流式細胞技術分析了病毒侵染后機體與細胞免疫因子的相關性，為尋找與疾病病程相關的靶向標志物，筆者對森林腦炎患者和健康人群進行了代謝組學檢測，并結合多元分析以闡釋疾病發病機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 50例森林腦炎患者(森林腦炎組)為呼倫貝爾牙克石市附近居民，有蜱蟲叮咬史，且出現發熱、四肢疼痛等癥狀，經血清學檢測，神經內科專家鑒定為森林腦炎。森林腦炎組中男39例，女11例；年齡25～68歲；IgG或IgM抗體呈陽性。健康對照組為內蒙古林業總醫院職工體檢健康者39例，其中男19例，女20例；年齡22～59歲；IgG或IgM抗體呈陰性。所有受試者均簽署了知情同意書。

森林腦炎組納入標準：符合《職業性森林腦炎診斷標準》[8]；外周血清特異性抗體IgM或IgG呈陽性，且IgM或IgG≥1∶20；年齡18～70歲。排除標準：近期有疫苗接種史；妊娠期、哺乳期。健康對照組納入標準：特異性抗體IgM或IgG呈陰性。排除標準：有蜱蟲叮咬史及森林腦炎疫苗接種史；患有其他疾病。

1.2儀器與試劑 LC-30AD液相色譜儀，日本島津公司；Triple TOF 5600質譜檢測器，美國AB Sciex 公司。甲醇(MEOH)、乙腈(ACN)試劑均為Optimal MS級別，美國Fisher Chemical公司生產；超純水為屈臣氏超純水；醋酸銨(純度≥98%)、氨水(純度28%～30%)購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3實驗方法

1.3.1標本前處理 取血清標本300 μL，加入900 μL提取液[ACN∶H2O=4∶1(V/V)]，旋渦混勻30 s，-20 ℃靜置1 h后于4 ℃，12 000 r/min離心15 min；小心取出600 μL上清液，等體積加入至兩個獨立的EP管中并在真空濃縮儀中干燥提取物；向干燥后的代謝物中加入200 μL提取液(提取液為初始梯度的流動相)，旋渦30 s。將標本于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，小心取出75 μL上清液于2 mL進樣瓶上機檢測。等體積血清標本各3 μL，標本混合后為質量控制樣(QC)。QC標本隨機穿插在標本序列中多次進樣，以監測儀器與方法的穩定性。

1.3.2檢測分析 為了全面覆蓋標本信息，采用非極性色譜柱及極性色譜柱進行生物標本的分離。針對中等極性及弱極性小分子化合物：色譜柱采用Acquity HSS T3 Column(以下簡稱T3色譜柱，1.8 μm,2.1 ×100 mm)，美國Waters公司；梯度洗脫采用流動相A：H2O(0.1% FA)；B：MEOH∶ACN=1∶1(V/V)。流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序信息見表1，質譜相關參數信息見表2。

表1 梯度洗脫程序詳細參數

表2 質譜詳細參數

針對強極性小分子代謝物：色譜柱采用Acquity UPLC BEH Amide Column(以下簡稱BEH Amide色譜柱，3 μm,2.1 mm×100.0 mm)，美國Waters公司；梯度洗脫采用流動相A：H2O(25 mmol/L CH3COONH4+25 mmol/L NH4OH)；B：ACN。流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序信息見表1，質譜相關參數信息見表2。

1.4統計學處理 質譜采集到的UPLC-QTOF-MS圖譜采用Analyst Software(美國AB Sciex公司)導出原始數據，通過基峰離子流色譜圖(BPC)及總離子流色譜圖(TIC)等判斷數據及平臺的可靠性。隨后利用XCMS plus及Markerview對采集到的潛在標志物進行定性及定量分析。將包含質荷比-保留時間、標本信息與峰面積三維數據進行校正后，將數據導入網絡版MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca/)進行數據的歸一化、去除同位素等處理，并進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS)等多元統計分析，篩選潛在標志物，并歸屬相應代謝通路，以尋求代謝通路變化與疾病之間的相關性。

PCA屬無師監督法，該處理法則主要是對標本信息進行降維處理，能夠實現標本分組的可視化分析，且不會造成重要信息的丟失，并對于建模的情況進行評估[9]。PCA模型的建立主要用于評估實驗建模的成功與否，其主要依據于QC標本的聚集程度，QC標本隨機穿插在進樣序列中，QC標本的聚攏程度可反映平臺的可靠性及實驗方法的重復性。OPLS主要依據多元統計變量VIP值、單變量P值及差異倍數值(FC)法則，對于標本之間的代謝物進行篩選挖掘[10]。篩選到的潛在標志物依據同位素模型分布原則、元素組成分析原則，縮小目標化合物范圍，在標準譜庫如京都基因和基因組數據庫(KEGG)、人類代謝組數據庫(HMDB)進行進一步篩選，依據實際譜圖與標準譜圖的對比匹配系數，進一步確定物質屬性。對于獲得的潛在標志物進行代謝通路富集分析，建立通路變化與生物背景之間的紐帶，解釋其生物學意義。

2 結 果

2.1BPC結果 血清標本正離子模式下基于T3色譜柱的圖譜見圖1。從圖中可以看出，色譜峰的峰型良好，進一步證實檢測平臺的可靠性。經80%去零規則消除缺失值，基于T3色譜柱正離子模式共鑒定到166個代謝物，BEH Amide色譜柱正負離子模式下分別得到181、182個代謝物，3種模式下，去掉重復信號，共得到410個代謝物。

圖1 森林腦炎組血清標本正離子模式下基于T3色譜柱的基峰離子流色譜圖

2.2PCA結果 從圖2可以看出，基于T3色譜柱及BEH Amide色譜柱，QC標本的聚集度均良好，表明建模的可靠性。

注：H為健康對照組；QC為質控組；T為森林腦炎組；A為T3色譜柱正離子模式下PCA圖，組成分PC1=67.2%，PC2=3.8%；B為BEH Amide色譜柱正離子模式下PCA圖，組成分PC1=55.6%，PC2=9.1%；C為BEH Amide色譜柱負離子模式下PCA圖，組成分PC1=21.1%，PC2=11.9%。

2.3差異代謝物提取和解析 基于UPLC-QTOF-MS血清代謝組學技術，在森林腦炎組和健康對照組中可鑒定到410個代謝物，這些物質同時經二級譜庫精確鑒定。利用XCMS plus及METLIN對生物學標志物進行篩選，MetDNA進行物質鑒定，實現了擬靶向分析。其中144個代謝物在兩組之間差異有統計學意義(P<0.05，VIP>1，FC>1.0)，所涵蓋的差異代謝物中，氨基酸水平整體呈下降趨勢，且脂肪酸水平同樣表現為下降趨勢。通過代謝通路富集分析，差異代謝物主要涵蓋了氨基酸、脂肪酸、花生四烯酸、白三烯等物質，所富集代謝通路主要為氨基酸代謝通路及與脂類代謝密切相關的代謝通路(包括脂蛋白生物合成、脂肪酸合成、花生四烯酸生物合成、白三烯生物合成等)。兩組間主要差異代謝物見表3。

表3 健康對照組與森林腦炎組的主要差異代謝物

續表3 健康對照組與森林腦炎組的主要差異代謝物

3 討 論

本研究結果表明，差異代謝物主要集中于氨基酸、脂肪酸、花生四烯酸、白三烯等物質，所富集代謝通路主要為氨基酸代謝通路，另外也發現了與脂類代謝密切相關的代謝通路，包括脂蛋白生物合成、脂肪酸合成、花生四烯酸生物合成、白三烯生物合成。脂肪酸合成、花生四烯酸合成、白三烯生物合成通路代謝紊亂與機體對病毒入侵所做出的免疫反應有著直接聯系[11]。氨基酸水平整體呈下降趨勢，這與大量病毒的入侵有關，病毒在機體內大量繁殖，需借助機體內氨基酸作為基底物質維持其生長，供自身細胞蛋白合成代謝所需[12]。同時，本研究監測到脂肪酸水平呈下降趨勢，這主要與宿主機體的機能有關，病毒在機體的復制、繁殖都需要能量供應，導致脂肪酸水平的降低。另外，脂質是細胞膜的主要組成成分，細胞膜的正常運行能夠保證細胞內環境的相對穩定，使各種生化反應能夠有序運行。病毒的入侵擾亂了機體的正常代謝，細胞做出相應的應激反應，細胞膜流動性發生了改變，從而導致脂類代謝紊亂[13]。

內源性花生四烯酸的產生主要是通過細胞膜磷脂的釋放來實現的。這一過程由磷脂酶A2家族酶催化，并由多種細胞激活信號誘導，包括炎癥或感染驅動的腫瘤壞死因子受體和Toll樣受體4的刺激[14]?；ㄉ南┧岬拇x對于人體健康和組織穩態調節具有重要意義?；ㄉ南┧釁⑴c調節細胞膜靈活性和流動性，在細胞信號傳導中作為脂質第二信使，誘導血管舒張及炎癥介質產生，參與病毒入侵過程機體出現的炎性反應[15-16]。

病毒的復制依賴于宿主的代謝機制和必要的細胞因子。氨基酸在所有病毒相關感染的發病機制中都發揮著重要作用，它們既是蛋白質合成的基底物，又是許多代謝途徑的調節因子[17-18]。有研究發現，氨基酸的代謝與慢性肝病存在緊密聯系，其中支鏈脂肪酸如纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸等水平在患病組中呈現下降趨勢，這可能與丙型肝炎病毒侵染組織并在組織中大量繁殖有關[19]?；ㄉ南┧峒捌溲苌锬軌騾⑴c多種代謝途徑，將免疫與脂質代謝聯系起來，蜱蟲叮咬人體后，機體會發生復雜的免疫應答以抵御病毒入侵，患者常會出現相應的炎性反應。急性炎性反應一般包含起始階段和消退階段，臨床表現為發熱、腫脹、疼痛和最終功能喪失等。炎癥的起始和消退主要由某些化學物質控制，包括蛋白質、肽和脂類物質(脂類主要包括白三烯和前列腺素等物質)[20]，森林腦炎患者體內花生四烯酸等脂類物質發生明顯變化，證實了這一觀點。

代謝組學作為基因組學、蛋白組學的下游研究技術，與表征、現象之間的聯系更加緊密。病毒侵染機體后，會在體內進行侵染-復制整個過程，機體則會呈現促炎-抗炎等炎性反應。目前關于森林腦炎的代謝過程及機制還未被完全解讀，本研究基于代謝組學技術深入剖析森林腦炎的整個機制，將機體炎性反應與代謝特征聯系起來，系統挖掘代謝機制，為疾病的診斷及預后提供了基礎依據，為后續研究打下了堅實的理論基礎。