蜜蜂人工授精技術研發(fā)歷程

彭成濤 劉鋒 袁芳 胡景華 駱群 徐細建 熊卓林 周偉良│文

江西省養(yǎng)蜂研究所，南昌 330052

一、前言

人工授精是一種通過控制動物的授精，改善動物繁殖和遺傳的技術[1]。Leeuwenhoek 和他的助手是第一個發(fā)現(xiàn)精子，并命名為精子的人[2]。1784 年，Spallanzani 首次在狗身上進行人工授精，并取得了成功。1899 年，Ivanovich Ivanoff 開創(chuàng)了人工授精作為實用程序的先河，到1907 年，已經(jīng)可以成功的在馬、家畜、狐貍、兔子和家禽身上進行人工授精研究[3,4]。

蜂王在進行婚飛時，既可以和同蜂場的雄蜂進行交配，也可以和其他蜂場中的雄蜂進行交配，但會更傾向于和同一種群，且不會在蜂箱內(nèi)[5]。由于蜂王自然交配無法控制其遺傳性狀，于是1740 年Reaumur最先開始嘗試控制蜂王交配，開啟了蜂王人工授精研究，后來Laidlaw 在1944 年進行蜂王人工授精取得了第一次成功[6,7]。由于雄蜂的來源受季節(jié)影響，且精液離體后難以保存，對保種育種工作帶來很大阻礙。本文作者闡述了蜂王人工授精、授精儀研究過程和雄蜂精液儲存等方面，以期能為今后蜜蜂育種保種工作提供幫助，并為未來研究方向提供參考。

二、國內(nèi)蜜蜂人工授精技術

在我國，舒少質(zhì)第一個介紹蜂王人工授精技術[8]，后來周崧將人工授精儀進行改進，使得人工授精技術在蜜蜂育種工作中得到應用[8]。黃文誠通過研究，解決了蜂王生殖道內(nèi)注射精液外溢的問題，且授精蜂王產(chǎn)卵率達到85%以上[8]。龔一飛等人通過研究，發(fā)明了CH-Ⅰ型微量注射器，使用這種儀器采集精液進行授精的成功率可達95%以上[9]。韓行舟等人研究發(fā)現(xiàn)，人工授精的蜂王與自然交尾的蜂王在生產(chǎn)性狀上差異不顯著[10]。福建農(nóng)學院養(yǎng)蜂系研究室研究發(fā)現(xiàn)，進行人工授精的處女王日齡在5～7 天最好，授精量為6μL 最佳，注射器插入陰門的深度為1mm為宜[11]。蘇榮茂等人利用漂洗離心技術使精子混合均勻，且蜂王能正常產(chǎn)卵，子脾整齊成片[12]。張其康和蘇榮茂等人研究發(fā)現(xiàn)精子在中性緩沖液中活力最高，在高滲（OP ≥470mosm/L）緩沖液中活力高于低滲（OP ≤330mosm/L）緩沖液中，且在漂洗液中加入半乳糖、果糖或葡萄糖能極顯著的提高精子活力[13,14]。

三、國外蜜蜂人工授精技術

Reaumur 最早嘗試控制蜂王交配，由于那個時候都認為蜂王是在蜂箱內(nèi)進行交配的，所以他把蜂王和雄蜂一起關在一個玻璃器皿內(nèi)，但并未成功[6]。后來Huber在1786 年到1789 年進行實驗，證明蜂王是在蜂箱外進行交配，在蜂箱內(nèi)不會交配，并嘗試通過細小鉛筆的方式將精液輸入蜂王陰道內(nèi)，最后結(jié)果失敗[15]。Huber在助手的幫助下，成為第一個證明蜂王是在巢外飛行過程中交配的[16]。后來Cramer、Dayitte 和Demaree等人進行控制蜂王交配的研究，結(jié)果均未成功，而Bruennich 和Heberle 提出的用隔離站來控制蜂王交配的方法被廣泛使用[17-21]。

1917 年Shafer 在前人的研究上，通過研究蜂王和雄蜂的性器官結(jié)構和功能，在顯微鏡下，使雄蜂的陰莖進入蜂王陰道內(nèi)，在多次嘗試中，取得了一次成功[22,23]。Bishop 在1920 年發(fā)表了兩篇論文，提出蜂王陰道內(nèi)的瓣突堵塞了輸卵管，阻礙了精液的注入[24]。Laidlaw 1944 年提出想要成功將精液通過人工授精注入陰道，必須繞過瓣突，后來通過儀器的改進，克服了瓣突的堵塞，成為第一個直接將精液注射到陰道的人[7]。1985 年，Harbo 等人對Laidlaw 的儀器進行了改進，設計出一種結(jié)構更精細、性能更優(yōu)良的人工授精儀[25]。2003 年周瑋翻譯的“小型萬維手動schley Ⅱ型人工授精儀的改進”中，介紹了該儀器在細微移動上具有極為精確的控制、大范圍轉(zhuǎn)動和靈活性等能力[26]。

四、蜂王麻醉方法研究

人工授精過程中，必須控制蜂王，因為即使是呼吸產(chǎn)生的微小動作也足以使得人工授精注射器尖端在插入陰道的過程變得非常困難[27]。于是人們開始研究麻醉劑，讓蜂王安靜，使授精更加方便。Nolan 最先嘗試使用乙醚作為麻醉劑，但發(fā)現(xiàn)死亡率很高[28]。此后，Laidlaw 等人進行多種麻醉劑試驗，發(fā)現(xiàn)使用二氧化碳效果最好，也可以刺激未受精的蜂王產(chǎn)卵，且發(fā)現(xiàn)如果沒有CO2麻醉，人工授精的蜂王產(chǎn)卵速度會很慢[29-31]。此外Cheeseman、Chen、Simpson 等人還研究了低溫麻醉和化學藥劑，如氯仿、異氟烷和氮，結(jié)果表明這些化合物都會對工蜂產(chǎn)生不良影響，主要包括記憶喪失、行為改變和時間調(diào)節(jié)失調(diào)，對蜂王的生理影響尚不清楚，但知道的是它們均沒有刺激卵巢激活和產(chǎn)卵的作用[32-34]。

五、注射器發(fā)展研究

為了提高授精成功率，人們開始對注射器進行研究。1927 年Watson 發(fā)明了一個帶有螺旋操作金屬柱塞的微型注射器，其中針頭為0.5mm 口徑的玻璃管，后來被人們廣泛使用[35,36]。直到1937 年，Nolan 覺得Watson 發(fā)明的注射器太大了，于是對其進行改進，他將原來玻璃管的螺旋結(jié)構改為機械鉛筆的管及原理，比原來的更堅固更細，針尖為細小針頭[37]。Laidlaw等人對Nolan 設計的鉛筆式注射器的針尖進一步改進，將針尖縮小，使針尖更容易進入陰道并減少傷害，能最大限度減少精液回流的損失[30]。由于以前的注射器容易碎，所以Roberts 在1947 年將注射器改進為鋁制，針頭為塑料且可以更換[38]。Mackensen 在1947 年設計了一種注射器，它的針頭和針頭管沒有密封的柱塞，而是針頭端部有可更換的橡膠隔膜，能夠?qū)⒕呵擅畹奈牒团懦鯷39]。1976 年，Gon?alves 將Mackensen設計的注射器長度縮短了，使得在操作上更加方便[40]。后來，Harbo 設計出了能儲存100～200μL 精液的玻璃毛細管，能夠?qū)Ψ渫踹M行多次授精而不需要為每只新蜂王單獨采集精液[25]。2014 年，F(xiàn)rancoy 等人設計了一種微型注射器，在Harbo 設計的基礎上，添加了一個可更換塑料圓筒，連接一個有機硅毛細管，頂端是一個玻璃毛細管用于人工授精[41]。

六、蜂王操作桿和注射器操作桿發(fā)展研究

1926 年以前，大多數(shù)人進行人工授精的時候都是用手抓著蜂王，這樣很不方便操作。1926 年Watson將蜂王用橡皮筋綁在支架上，左手用鑷子將腹部末端打開，使陰道充分暴露出來，注射器用操作桿夾著，能夠控制注射器向任何方向移動[36]。但這個設計存在陰道瓣突會阻礙精液進入輸卵管且容易損傷蜂王的缺點，但也標志著蜂王人工授精精密儀器發(fā)展的開端。1932 年Nolan 對Watson 的設計進行改進，操作器橫放在顯微鏡的臺子上，兩端安裝一根柱子，柱子之間有一鋼架，方便放被禁錮在玻璃管的蜂王，蜂王腹部蜇針腔能從玻璃管一端突出來，柱子上都有一個有孔且可調(diào)節(jié)的木塊，這個孔可以插入操作桿，操作桿尖端呈鉤子狀，用來打開蜂王的蜇針腔，注射器被固定在右邊木塊上，從而降低了損傷蜂王的風險[42]。后來Mackensen 改進了這個儀器，由鋼和鋁構成，在關蜂王的玻璃管下面增加一個孔，二氧化碳能夠通過橡膠管進入這個孔，到達蜂王體內(nèi)，打開蜂王蜇針腔操作桿的探針均位于兩邊可調(diào)節(jié)的柱子上，注射器在右邊柱子上，正對著蜂王蜇針腔的位置[39]。1938 年Laidlaw 對授精儀進行了改進，打開蜂王蜇針腔背側(cè)和腹側(cè)帶鉤子的操作桿固定在通過螺絲釘能向上向下移動的柱子上，注射器安裝在可調(diào)節(jié)的機械臂上，能夠上下移動及隨時取下，而關蜂王的臺子能夠?qū)⒎渫鮾A斜至任意角度，使注射器可以順利插入陰道[5]。

七、雄蜂精液采集研究

傳統(tǒng)的雄蜂精液采集都是用手稍微擠壓雄蜂的腹部，使得雄蜂生殖器外翻并射精，這種方法采集精液要花費很長時間才能滿足蜂王所需精液量。于是Komlatsky 等人研究出一種電刺激取精的電射精器，這個儀器主要使用交流電，強度不超過5μA，保證了工作的安全性，且經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，使用這個儀器能降低60%以上的成本，對精子質(zhì)量沒有負面影響，蜂王產(chǎn)卵更加活躍，開產(chǎn)時間提前3～4 天，蜂群生產(chǎn)指標也有提升[43]。

1.雄蜂精液零上溫度儲存

蜂王儲精囊中含有蛋白質(zhì)、糖和抗氧化劑，周圍的氣管網(wǎng)可以提供氧氣，因此雄蜂精液在儲精囊中能夠存活幾年[44,45]。而精液在體外存活的時間非常短，所以人們對雄蜂精液保存技術進行研究，并取得了一些成功。Cobey 等人研究發(fā)現(xiàn)新鮮的雄蜂精液可以在高于冰點的溫度下儲存幾周而不喪失精子活力[46,47]。Harbo and Williams 研究發(fā)現(xiàn)精子可以儲存在13℃和25℃[48]。Locke 和Collins 研究發(fā)現(xiàn)當精液儲存在12℃到16℃之間時，精子活力似乎更高，結(jié)果表明在12℃下貯存6 周后，精子存活率可達70%～80%，且在12℃保存39 周后，精子存活率仍可達65%，這是蜂王足夠生育的最大儲存量[49-51]。此外，Poole和Tabe 研究發(fā)現(xiàn)，15℃保存13 周后的精子活力高于24℃保存的精子活力[52]。

研究結(jié)果表明，原精液難以長期儲存，于是人們開始對精液保護劑、稀釋劑等方面的研究。Almeida和Soares 研究發(fā)現(xiàn)在精液中加入綠色椰子汁和二氫鏈霉素能夠室溫下貯藏2 周失活不顯著，這為短途運輸提供了有效方法[53]。Collins Anita M.研究發(fā)現(xiàn)將采集的精液稀釋后，保存在密封的毛細管中，在室溫25℃和冰箱12℃中可以保存1 年時間，但在前9 周后存活率下降了50%[54,55]。Hopkins 等人通過在儲存管上涂上一層抗生素凝膠，可以在14℃下儲存活精液一年以上，但存活率也只有50%[56]。

低溫保存對精子有損傷作用，影響精子成活率和功能。例如，精子質(zhì)膜的功能完整性是精子代謝所必需的，對精子的卵母細胞融合起著重要作用，因此，膜的完整性對精子與卵母細胞融合至關重要[57]。然而，精子低溫保存后，在恢復過程中會發(fā)生結(jié)冰、脂質(zhì)過氧化和冷休克，會破壞膜的通透性和完整性，冷休克使質(zhì)膜失去選擇性滲透性，影響精子功能[58-62]。低溫保存對精子的頂體也有損傷作用，影響生育功能[63,64]。

2.雄蜂精液超低溫儲存

Sawada 等人研究發(fā)現(xiàn)，雄蜂精液冷凍在-79℃環(huán)境中后，精子可以恢復正常活力[65]。Melnichenko and Vavilov 是第一個報道蜜蜂精液在-196℃低溫保存成功的人，他們將雄蜂精液與雄蜂的血淋巴混合，并冷卻到-196℃，解凍后精子仍然是活躍的、有活力的[66]。

在哺乳動物中二甲基亞砜（DMSO）通常用于精液的冷凍保存，于是Harbo 對DMSO 進行研究，發(fā)現(xiàn)將DMSO 作為蜜蜂精液的冷凍保護劑使用時，解凍后的精子活力良好，但與未經(jīng)DMSO 處理的精子授精的蜂王相比，用DMSO 處理的精子受精的蜂王產(chǎn)工蜂數(shù)量減少[67,68]。Hopkins 等人對蛋黃進行研究，發(fā)現(xiàn)最后的授精成功率與Harbo 的相似[69]。為了減少DMSO對蜂王生育的負面影響，Wegener、Paillard 和Gül 等人試圖減少解凍精液的冷凍保護劑濃度，通過添加額外的DMSO-free 稀釋劑和使用前將精液離心“清洗”，然而這些操作對精子的存活沒有任何作用或者僅有不顯著的作用[70-72]。

離心分離法在雄蜂精液處理中有很多作用，如可以將被稀釋的精液再濃縮、去除精液中的氣泡、除去冷凍解凍雄蜂精液中對精子和蜂王有毒性的冷凍保護劑[73-77]。但有研究發(fā)現(xiàn)，離心分離法會損傷精子，Collins 發(fā)現(xiàn)使用離心分離法后，只有34.1%的精子細胞還能呈現(xiàn)完整的細胞膜[78]。有研究表明使用離心精液受精的蜂王產(chǎn)的雄蜂會增加，且到達儲精囊的精子細胞數(shù)量顯著減少[79,80]。莊明亮等人通過兩步平衡法將冷凍稀釋劑和保護劑分別平衡、利用程序降溫和離心處理的冷凍方法處理精液，精子保存1 年后，存活率可達80%左右，精子仍保持較高活力[81]。

八、展望

蜜蜂人工授精是世界上許多蜜蜂培育項目的基礎。在沃森開創(chuàng)性實驗研究之后不到一個世紀的時間里，蜜蜂人工授精已經(jīng)發(fā)展成為一種非常有效且被廣泛應用的程序。人工授精技術能夠加速蜜蜂的遺傳選擇，儲存的精子能極大的促進群體遺傳改良，延長蜜蜂的繁殖季節(jié)。

短期和長期的精液保存都能增強蜜蜂群體的選擇和遺傳改良。此外，運輸蜜蜂精液而不是活的雄蜂可以減少傳播蜜蜂病原體的風險。于是人們加大了對精液保存的研究，目前莊明亮等人提出的精液保存方法效果最好，這種方法能有效降低保護劑對精子的毒害作用，且提高精子存活率，從而延長保存時間，為蜜蜂精液長期超低溫保存研究提供創(chuàng)新思路，進而為蜜蜂種質(zhì)資源保護工作提供幫助。