蜜蜂嗅覺識別過程的分子機制

任勤 王瑞生 姬聰慧 曹蘭 劉佳霖 陳恒 蔣雨

（重慶市畜牧科學院，榮昌 402460）

蜜蜂作為高度社會化的昆蟲，嗅覺系統在其生命活動中具有重要作用。依靠復雜的嗅覺系統，可以識別個體和群體之間各類信息素和外界環境中的各種氣味物質，如蜂王通過信息素來實現對蜂群的調控、蜂王與雄蜂的交配、產卵、分工、分蜂、防衛、尋找蜜源并準確定位等[1,2]。蜜蜂可以鑒定和識別環境中不同的化學氣味，并將這些化學信號轉化為電信號，引起蜜蜂不同的行為反應，如群居、覓食、抵御天敵、交配等[3-5]，從而使其能適應環境選擇以保證群體的生存和種群繁衍。如何對環境中特定的氣味進行準確識別及選擇，就需要蜜蜂敏銳的嗅覺識別系統，而蜜蜂對特定氣味的識別是一個復雜的過程，多種蛋白參與了對氣味分子的識別[6]。隨著遺傳學、生物學等研究的不斷深入，更依賴于現代分子技術，如氣相色譜-觸角電位聯用技術、RAN 原位雜交等技術的發展，對蜜蜂嗅覺識別機制的研究更加深入。本文對蜜蜂嗅覺識別系統結構及功能、參與嗅覺識別的蛋白及嗅覺識別機制進行綜述，以期進一步探索嗅覺識別在蜜蜂飼養、疾病防控等領域的作用以及為蜜蜂嗅覺識別機制的研究提供參考依據。

1 嗅覺感受器及其識別過程

蜜蜂的社會活動很大程度上受到各種外界環境刺激影響，如味覺、嗅覺及各種觸覺刺激等，而觸角是感受這些刺激的主要化學感受器官，起著調節蜜蜂行為生理等各種環境刺激因子的關系[7,8]。蜜蜂依賴觸角感受外界環境各種信號，經神經傳導、綜合協調而對外界作出各種應答反應，產生各種行為表現形式，因此觸角對于蜜蜂維護蜂群間關系、繁殖、行為控制等方面發揮著重要作用。和大多數昆蟲一樣，蜜蜂的嗅覺感受器主要分布在觸角、下顎須和唇須上，在尾須上也有少量分布。在蜜蜂的觸角上分布著不同的各種感受器，可對外界各種刺激進行感受[9,10]，其中板形感受器、毛形感受器、錐形感受器，都是觸角中主要嗅覺感受器[11,12]。不同型級的蜂觸角上嗅覺感受器數量明顯不同，說明其嗅覺能力有所差異[13]。

每個嗅覺感受器包含1～4 根嗅覺神經元（ORNs），這些神經細胞屬于雙極神經元，樹突端延伸到嗅覺感受器，并浸沒在表皮細胞分泌的富含鉀離子和蛋白質的淋巴液內，樹突部的細胞膜上能特異性表達相應的嗅覺受體蛋白，表達相同嗅覺受體ORNs 的軸突端匯集到觸角葉中相同的嗅小球中。觸角葉中的功能組織與脊椎動物的嗅球相似，是傳遞和處理嗅覺信息的初級中樞。在嗅小球中，ORNs 的突觸連接到二級神經元，稱為投射神經元（PNs），PN 的軸突投射到位于蘑菇體（MB）和原腦葉外側角（LH）等區域的三級神經元，從而在腦部形成關于該氣味分子的抽象信息，引發相應行為[14]。

一般來說，嗅覺識別過程大致分為以下三步：（1）外界環境中親脂性的氣味分子通過昆蟲觸角感器表皮上的微孔進入親水性的感器淋巴液，與感器淋巴液中的可溶性氣味結合蛋白（OBP）結合，形成氣味分子-OBP復合體；（2）復合體穿過親水性的嗅覺淋巴液，到達神經樹突膜上的氣味受體（ORs）；（3）氣味受體受到刺激后，膜通透性發生改變，產生動作電位，同時氣味分子在OBP 作用下又迅速失活，然后在氣味降解酯酶和谷胱苷肽轉移酶的作用下降解[1,15]。

2 嗅覺識別系統構成

蜜蜂的嗅覺系統構成非常復雜，其主要功能由感受器、氣味結合蛋白（OBPs）、氣味受體（ORs）、感覺神經元膜蛋白（SNMP）、化學感受蛋白（CSPs）和氣味降解酶（ODEs）等相互協調運行完成[16]。蜜蜂的嗅覺識別是一個復雜的過程，氣味通過觸角感受器進入感受器淋巴液中，然后經過多種蛋白參與完成氣味分子的識別[17,18]。

2.1 氣味結合蛋白

蜜蜂觸角上的感覺神經元是識別氣味的基礎物質，其主要分布在親水性的淋巴液中，而蜜蜂能感受的氣味物質多為脂溶性分子化合物，其不能直接經過親水性的淋巴液到達嗅覺神經元，必須與某種蛋白結合才能運輸到氣味受體（ORs），而執行此功能就是氣味結合蛋白（OBPs）[18,19]。氣味結合蛋白識別氣味分子介導至嗅覺感受神經元的觀點已被廣泛接受，在氣味識別過程中，OBPs 主要功能有：（1）OBPs 在氣味識別中起到了外周濾器的作用，能夠選擇性識別和結合特異的氣味分子；（2）OBPs 通過親水性的淋巴液運輸脂溶性氣味分子；（3）OBPs 幫助氣味分子通過特殊途徑到達受體蛋白，促進信號傳導；（4）OBPs 可能清除外周感器中不需要的或有毒物質；（5）OBPs 迅速使完成刺激的氣味分子失活[17]。

有研究發現，西方蜜蜂中存在一類觸角特異蛋白（ASPs），包括觸角特異蛋白ASP1 和 ASP2[20,21]。原位雜交結果顯示，基因ASP1 在工蜂和雄蜂的觸角嗅覺器官中均大量表達，主要與蜂王信息素物質結合[22]。化學感受蛋白ASP2 是一種水溶性蛋白，因其高豐度地表達于工蜂觸角，且不能與蜂王信息素的任何成分結合，加之其結構上的特點，將化學感受蛋白ASP2歸為普通氣味結合蛋白[23]。

通過半定量RT-PCR 及斑點分析法和蛋白質組學等方法，發現西方蜜蜂基因組上共有21 個OBPs，其中有9 個OBPs 基因在觸角中特異性表達，其余基因在各個組織或其他特異組織中表達，并對這21 個OBPs 在不同蜂型和不同年齡西方蜜蜂下頜腺中的表達情況進行詳細研究，揭示了OBPs 家族成員的表達差異[24,25]。李紅亮利用RT-PCR 技術分析了ASP1 及ASP2 基因的時空表達情況，結果發現，Ac-ASP1 高豐度地表達于工蜂觸角，而在其他器官中呈低豐度表達，Ac-ASP2 特異地表達于工蜂觸角的嗅覺感器上，在其他器官中均不表達[26]。蜜蜂依賴氣味結合蛋白完成了對外界成千上萬氣味物質識別過程的第一步，氣味結合蛋白OBPs 參與識別轉移疏水性的氣味物質，進而產生相應的嗅覺行為反應[17]。

2.2 化學感受蛋白

昆蟲化學感受蛋白（CSPs）是在長期進化過程中形成的一類低分子量酸性可溶性蛋白，廣泛分布于昆蟲觸角、跗節等各種化學感受器中，其主要功能是識別結合運輸非揮發性分子。

Danty 于1998 年在意大利蜜蜂觸角中發現了CSP基 因，命名為ASP3，ASP3含3個亞型-ASP3a、ASP3b 和ASP3c，其中ASP3a 和ASP3c 在工蜂和雄蜂的觸角中都有發現，而ASP3c 只存在于雄蜂觸角中[21]。2006 年Foret 在意大利蜜蜂中鑒定出6 個CSP 基因，并將它們命名為CSP1-6，其中的CSP1、CSP2 即分別為ASP3b 和ASP3c 基因[24]。CSP1、CSP2、CSP4 在意大利蜜蜂和中華蜜蜂觸角中都表達，Am-CSP4 只在觸角中表達；Ac-CSP3 在蜜蜂翅中的表達量最高，而Am-CSP3 在觸角中表達豐富。CSP5 和CSP6 都在意大利蜜蜂卵和卵巢中表達，但CSP6 也在其幼蟲期、蛹期和成蜂頭中表達。而在中華蜜蜂中，CSP5 在各個發育期都表達且表達量較為穩定，CSP6 只在蛹期表達[27-30]。

利用蒽甲酸類脂肪酸ASA 作為熒光探針，結果表明ASP3c 與大量脂肪酸及其衍生酯類特異結合，不能與普通氣味分子及其他信息素結合，序列分析表明，CSPs 在節肢動物中是較保守的基因家族，廣泛的表達于各感覺器官中，是具有多種功能的蛋白質，在化學感受信號轉導過程中發揮重要作用[18]。

2.3 氣味受體蛋白

嗅覺的識別和傳導從氣味分子與嗅覺神經元樹突膜上的氣味受體（ORs）的相互作用開始，其主要功能是與氣味分子結合后改變細胞膜上的離子通道產生動作電位。昆蟲的ORs 一般分為兩類：一類是典型嗅覺受體，這些ORs 基因高度變異同源性低；另一類其基因在不同昆蟲間較為保守，同源性可高達70%以上，是傳統嗅覺受體（olfactory receptor coreceptor family，Orco；在果蠅中被命名為Or83b）[16]。

2003 年，Krieger 等利用PCR 方法從西方蜜蜂中擴增出第一個氣味受體基因AmeLR2，其在大多數觸角感覺神經中表達[31]。2006 年，Robertson 和Wanner利用生物信息學方法，從西方蜜蜂全基因組中共鑒定出170 個ORs 基因，其中有7 個假基因。通過系統發育學分析，將這170 個ORs 分為5 個亞家族，其中有4 個小的亞家族和1 個大的亞家族（包含157 個ORs），在這個大的亞家族中，多數ORs 都是串聯排列的，并經過聚類分析找到了西方蜜蜂的Or83b 家族成員，定名為AmOr2[32]。采用RT-PCR 技術對任意選擇的10 個ORs 基因在意大利蜜蜂中的組織特異性表達情況進行檢測，結果表明，有7 個ORs 基因在蜜蜂的觸角中高度表達。與其他昆蟲相比，蜜蜂擁有數量較多的氣味受體，這個龐大的氣味受體家族可能與它們之間的社會交流和覓食行為有關[18]。Wanner 等研究表明，Or10、Or11、Or18 和Or170 這4 個基因在西方蜜蜂雄蜂中高表達，通過電生理學的研究結果發現，雄蜂的Or11 僅是對9-氧代-癸烯酸（9-ODA）反應敏感的氣味受體[33]。氣味受體家族在蜜蜂基因組中是最有代表性的例子，通過描述該物種的進化地位和性別特定基因的表達，為研究蜜蜂對信息素、親屬間的識別信號、多種花的氣味檢測提供了條件[34]。

2.4 感覺神經元膜蛋白

感覺神經元膜蛋白（SNMPs）是富集于完全變態昆蟲觸角中的重要嗅覺功能蛋白，分為SNMP1 和SNMP2 兩個亞族[35]，最早在鱗翅目昆蟲的嗅覺受體神經中發現SNMPs，研究表明這類蛋白可能在識別氣味分子上具有重要作用。Nichols 等研究發現，西方蜜蜂中有8 個CD36 同源的候選基因[36]。胡穎穎等于2013 年克隆表達出中華蜜蜂神經元膜蛋白AccSNMP1編碼區，該基因1563bp 編碼520 個氨基酸，并且AccSNMP1 在各個部位都表達，但在觸角中表達最為豐富[37]。

目前，SNMP 在氣味識別中的生化作用機理還處于假說階段，根據前人的研究，可推斷出SNMP 的作用大體上有四種，分別是：（1）SNMP 可能是氣味分子或OBP-氣體分子復合物的受體；（2）參與氣味分子從OBP-氣體分子復合物上釋放；（3）SNMP 可能以SNMP-OR 復合體的形式參與氣味識別；（4）SNMP 將氣味分子或OBP-氣體復合物傳遞至神經元細胞中。這些作用都表明感覺神經元膜蛋白在昆蟲嗅覺感受中起到很重要的作用[34]。

2.5 氣味降解酶

信號失活在所有化學機制中都具有重要意義，在嗅覺中也不例外[35]。氣味降解酶（ODEs）能使信號迅速失活，這對昆蟲嗅覺具有重要作用，因為ODEs能避免持續信號刺激和保證后續嗅覺感知的傳遞。ODEs 主要包含酯酶（EST）、細胞色素P450 氧化酶（P450）、谷胱甘肽-s-轉移酶（GST）和醛氧化酶（AOX），并且這些酶中很多都具有解毒功能[16]。目前對氣味分子失活機制的研究存在2 種觀點，一種觀點認為是氣味降解酶（ODEs）使氣味分子失活，另一種觀點則認為氣味分子先通過OBP 失活，而后被ODEs 降解[35]。

3 嗅覺識別機制

蜜蜂具有高度特化和靈敏的嗅覺系統，來識別環境中不同的氣味信號，當氣味分子與嗅覺系統中的受體結合后，產生一系列的行為反應，這一識別過程及反應可以使蜜蜂更好地尋找蜜源、交配以及尋找繁殖場所和躲避外界環境的傷害等。

昆蟲嗅覺系統機制有兩種假說：其一是氣味分子與感受蛋白結合后被運輸到嗅覺神經元的樹突上，因氣味分子帶有負電荷氣味分子的積累，使得嗅覺神經元樹突周圍的pH 發生變化，從而導致氣味分子與感受蛋白分離后與嗅覺受體結合產生動作電位；其二是氣味分子與感受蛋白結合后，與感受神經元膜蛋白（SNMP）相互作用激發OR，OR 與G-蛋白偶聯后，由效應器激發第二信使，隨著第二信使的增加激活離子通道，最后氣味被氣味降解酶降解[16]。

Sato 等和Wicher 等在2008 年同時發現一個新的嗅覺形成模型，他們認為，在Ors-Or83b 二聚體形成后會產生一個配體門離子通道，只有在該配體門離子通道存在時分子信號才能傳遞，而且他們都認為通過打開配體門離子通道，直接產生動作電位是昆蟲獨特的對外界環境作出反應的基礎，這表明昆蟲具有與其他物種完全不同的信號傳導方式，昆蟲獨特的信號傳導方式將有利于它們更好地識別化學信息，從而適應多變的外界環境，對其生存有重大意義[38,39]。

4 展望

嗅覺對蜜蜂信息交流具有重要作用，由于其復雜性，目前的研究結果都尚未完整的闡述清楚蜜蜂的嗅覺系統是如何調控蜜蜂的各種行為。雖然對化學感受器、信息素物質篩選與合成以及對OBPs、CSPs、ORs、ODEs、SNMPs 等嗅覺相關蛋白進行了深入研究，但仍缺乏關于信息素物質對昆蟲嗅覺相關蛋白的作用、嗅覺相關蛋白之間、嗅覺相關蛋白與氣味物質間的相互作用以及昆蟲嗅覺的感受途徑等方面的綜合性研究。

可以用RNA-Seq 技術研究不同行為表現下蜜蜂觸角幾乎所有基因的表達情況；可以利用信息素成分或氣味分子與OBP 或者CSP 是如何結合與釋放的，以及它們與受體結合后是怎樣產生電信號的，以及用信息素成分或氣味分子刺激蜜蜂，分析嗅覺候選基因的表達是否受到影響；也可以利用western blot 和免疫熒光等技術，對嗅覺相關基因進行定位，以及研究它們之間是否存在互作關系，逐步探明蜜蜂嗅覺機制與行為發育的關系。蜜蜂觸角上分布著成千上萬個感覺器，能感受環境中各種揮發性氣味分子，賦予蜜蜂靈敏的嗅覺，而且蜜蜂可以通過學習識別新的氣味，具有可塑性[16]。因此研究蜜蜂的嗅覺識別機制，不僅有助于了解蜜蜂是怎樣感受和識別環境中的氣味物質并產生相應的行為反應的，而且蜜蜂作為一種模式生物，還有巨大的潛在應用價值。