復合益生菌固體飲料調節小鼠腸道菌群的研究

◎ 嚴建剛，姚康飛，郭亞娟，李 艷，袁 方，毛新亮

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400）

腸道被喻為人體的“第二大腦”，也是人體最大的消化器官，腸道疾病與人體健康息息相關[1]。腸道疾病以炎癥性腸病居多，它是一種非傳染性疾病，會引起腹瀉、腹痛、便血、嘔吐和營養不良等癥狀，嚴重時誘發結腸癌。美國華盛頓大學健康指標和評估研究所聯合消化疾病研究所的統計報告顯示，從1990年到2017年，全球炎癥性腸炎患病人數從370萬人上升到680萬人，增加了85.1%[2]。臨床研究表明，腸道菌群失調是腸道疾病重要激發因素之一，主要表現在有益菌群數量減少和有害菌群數量增多[3-4]。

益生菌是一類通過定植在人體內，改變其菌群組成，并對其產生有益作用的活性微生物[5]。當攝入一定數量益生菌后，能促進腸道有益菌增殖，進而調節宿主腸道內菌群。腸道菌群在宿主中參與營養物質分解、調控代謝、維穩免疫系統等多方面生理活動[3]，從而影響炎癥反應發生[6-7]。目前，市場上益生菌類食品主要添加乳桿菌和雙歧桿菌。乳雙歧桿菌HN019是一株從酸奶中分離得到的革蘭氏陽性菌，具有促進腸道蠕動、抗炎癥和調節免疫等功效[8]。鼠李糖乳桿菌HN001最初從干酪中分離出來，該菌株作為乳制品的一部分被應用20多年，具有抵抗結腸炎癥、降低膽固醇以及調節腸道菌群的作用[9-10]。嗜酸乳桿菌NCFM是一種從健康人體糞便中分離出來的菌，具有良好耐酸、耐膽鹽特性，在臨床實驗中口服能改善功能性腸病患者腹脹[11]。

隨著健康意識的增強，人們疾病醫學的理念逐漸從治療轉向預防，因此從日常膳食補充劑出發尋求有效調理腸道菌群功能的食品以預防炎癥性腸病是健康產業發展的重點。本文將嗜酸乳桿菌NCFM、鼠李糖乳桿菌HN001和乳雙歧桿菌HN019制備復合益生菌固體飲料，通過《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）對小鼠糞便菌群進行分析，以研究復合益生菌制劑對小鼠腸道菌群的調節作用，為預防炎癥性腸病功能食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

復合益生菌固體飲料（完美億生菌固體飲料TM，不少于1×1010CFU·g-1活菌，成分：鼠李糖乳桿菌HN001、嗜酸乳桿菌NCFM、乳雙歧桿菌HN019、赤蘚糖醇、低聚果糖和藍莓粉），由完美（中國）有限公司提供。磷酸鹽緩沖液（0.01 mol·L-1，pH=7.2）和吐溫80由國藥集團化學公司提供；伊紅美藍瓊脂由廣東環凱微生物公司提供；革蘭氏染色液試劑盒、BBL瓊脂、D-環絲氨酸和胰?-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂由青島高科園海博生物公司提供；LBs瓊脂、疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂和檸檬酸鐵銨由北京陸橋技術公司提供。

酸鹽緩沖液（0.01 mol·L-1，pH=7.2）配制：磷酸氫二鈉2.58 g，磷酸二氫鈉0.44 g，用純凈水溶解并定容至1 L，115 ℃高壓殺菌20 min，冷卻至室溫備用。

培養基配制：按試劑盒說明書配制，115 ℃高壓殺菌20 min，冷卻至室溫，現配現用。

1.1.2 實驗動物

40只雄性Balb/c小鼠（SPF級），體重范圍為20.5～22.4 g，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，許可證號：SCXK（湘）2016-0002；恒溫恒濕飼養，溫度為（23±2）℃，濕度為45%～60%。

1.1.3 儀器與設備

PL2002電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）公司；BSC-1100ⅡA2-X生物安全柜，濟南鑫貝西生物公司；LDZM-80KCS蒸汽滅菌鍋，上海申安儀器公司；PYL-230電熱恒溫培養箱，天津市萊伯特瑞儀器公司；SPL-250培養箱，天津市萊伯特瑞儀器公司；BX43型生物顯微鏡+MD50型數碼成像系統，奧林巴斯（上海）公司；MS105DU電子分析天平，梅特勒-托利多中國有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥方法

選用檢疫合格的雄性Balb/c小鼠40只，隨機分為4組，即空白對照組、復合益生菌固體飲料低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。復合益生菌固體飲料低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠每天分別灌胃0.33 g·(kg·bw)-1、0.67 g·(kg·bw)-1、1.00 g·(kg·bw)-1益生菌固體飲料。所有樣品用水溶解，并按20 mL·kg-1灌胃，空白對照組每天灌胃相同劑量純凈水，每日一次，連續灌胃30 d，并每天定時對小鼠進行稱重，并監測其攝食量。

1.2.2 小鼠腸道菌群檢測

給樣前、給樣第14 d后的第24 h及給樣第30 d后的第24 h，分別在無菌干燥環境下收集小鼠肛門新鮮糞便并稱重，保存置無菌離心管，隨后加入磷酸鹽緩沖液（0.01 mol·L-1，pH 7.2）稀釋振蕩，使糞便終濃度為0.01 g·mL-1，設定為10-1。根據預實驗結果，用磷酸鹽緩沖液對母液進行10倍梯度稀釋，選擇3個合適的稀釋度進行培養計數。雙歧桿菌培養：母液稀釋至10-4～10-6，接種在BBL瓊脂培養基，置于37 ℃厭氧環境中培養48 h。乳桿菌培養：母液稀釋至10-4～10-6，接種在LBs培養基，置于37 ℃厭氧環境中培養48 h；腸球菌：母液稀釋至10-1～10-3，接種在疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂培養基，置于37 ℃有氧環境中培養48 h；腸桿菌：母液稀釋至10-1～10-3，接種于伊紅美藍瓊脂培養基，置于37 ℃有氧環境中培養48 h；產氣莢膜梭菌：母液稀釋至10-1～10-3，接種于TSC瓊脂培養基，置于37 ℃厭氧環境中培養24 h。依據《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版）調節腸道菌群功能檢驗方法，通過菌落形態比較、革蘭氏染色鏡檢等相應方法鑒定，確定樣品生長菌落為目標菌后，計數并乘以稀釋倍數，以菌落數的對數值（lgCFU·g-1）表示，并按結果判定標準進行實驗結果判定。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 復合益生菌固體飲料對小鼠生長的影響

由表1可知，在實驗期間，所有小鼠精神狀態、活動、攝食、排泌等均未見明顯異常，體重緩慢增長。與空白對照組相比，各實驗組小鼠平均體重在喂食復合益生菌固體飲料期間均未見異常。上述結果表明復合益生菌固體飲料對小鼠的生長無不良影響。

表1 復合益生菌固體飲料對小鼠體重的影響表（±s，n=10）

表1 復合益生菌固體飲料對小鼠體重的影響表（±s，n=10）

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2.2 復合益生菌固體飲料對小鼠腸道菌群的影響

2.2.1 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便腸桿菌菌落數的影響

由表2可知，干預前各組小鼠間糞便中腸桿菌菌落數均未見統計學差異；干預14 d后，與干預前相比，高劑量組小鼠糞便腸桿菌菌落數顯著減少（P＜0.05）。干預30 d后，與空白對照組相比，中劑量組小鼠糞便腸桿菌菌落數顯著減少（P＜0.05）；與干預前相比，中劑量組小鼠糞便腸桿菌菌落數極顯著減少（P＜0.01）。整體而言，復合益生菌固體飲料對小鼠腸桿菌菌落具有抑制作用。

表2 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便腸桿菌菌落數的影響表（±s，n=10）

表2 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便腸桿菌菌落數的影響表（±s，n=10）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與同組干預前相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2.2 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便腸球菌菌落數的影響

由表3可知，干預前各組小鼠間糞便中腸球菌菌落數均未見統計學差異；與空白對照組相比，喂食30 d后，中劑量組小鼠糞便腸球菌菌落數顯著減少（P＜0.05）。與干預前相比，干預14 d后低劑量組和高劑量組小鼠糞便腸球菌菌落數均極顯著減少（P＜0.01），干預30 d后復合益生菌固體飲料所有組別小鼠糞便腸球菌菌落數均顯著或極顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），該結果表明復合益生菌固體飲料對腸球菌的定植具有阻抗作用。

表3 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便腸球菌菌落數的影響表（±s，n=10）

表3 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便腸球菌菌落數的影響表（±s，n=10）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與同組干預前相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2.3 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便產氣莢膜梭菌菌落數的影響

由表4可知，干預前各組小鼠間糞便中產氣莢膜梭菌菌落數均未見統計學差異；與空白對照組相比，各組小鼠糞便產氣莢膜梭菌菌落數較干預前均未見統計學差異；與同組干預前相比，干預30 d后高劑量組小鼠糞便產氣莢膜梭菌菌落數顯著降低（P＜0.05），表明復合益生菌固體飲料具有減少產氣莢膜梭菌作用。

表4 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便產氣莢膜梭菌菌落數的影響表（±s，n=10）

表4 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便產氣莢膜梭菌菌落數的影響表（±s，n=10）

注：與同組干預前相比，#P＜0.05。

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2.2.4 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便乳桿菌菌落數的影響

由表5可知，干預前各組小鼠間糞便中乳桿菌菌落數無顯著差異；干預14 d后，與同組干預前相比，中劑量組小鼠糞便乳桿菌菌落數顯著增加（P＜0.05），表明復合益生菌固體飲料可增加乳桿菌的定植，對腸道微生物結構具有調節作用。

表5 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便乳桿菌菌落數的影響表（±s，n=10）

表5 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便乳桿菌菌落數的影響表（±s，n=10）

注：與同組干預前相比，#P＜0.05。

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2.2.5 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便雙歧桿菌菌落數的影響

由表6可知，干預前各組小鼠間糞便雙歧桿菌菌落數均未見統計學差異；干預14 d后，與空白對照組相比，各給樣組小鼠糞便雙歧桿菌菌落數均未見統計學差異；干預30 d后，與同組干預前相比，低劑量組小鼠糞便雙歧桿菌菌落數均顯著增加（P＜0.05），表明復合益生菌固體飲料可增殖腸道雙歧桿菌，增加腸道有益菌數量。

表6 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便雙歧桿菌菌落數的影響表（±s，n=10）

表6 復合益生菌固體飲料對小鼠糞便雙歧桿菌菌落數的影響表（±s，n=10）

注：與同組干預前相比，#P＜0.05。

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3 結論與討論

胃腸道中存在龐大而復雜的微生物，是人類健康和疾病的重要決定因素。健康生理狀態下，腸道微生物處于平衡的共生生態系統中，可對食物中的營養素進行分解、消化以及促進吸收，保護腸道屏障防止病原體入侵，維持人體的正常功能。然而，這種平衡可能會被日常條件改變，如藥物使用或干擾腸道生理學的病理，產生不利于生物體的環境。當腸道致病菌微生物占主導，會引發代謝功能紊亂，免疫力低下和器官病變。常見致病菌大多是腸桿菌和腸球菌，為革蘭氏陰性菌，在體內產生毒素因子，破壞腸黏膜的完整性，引起炎癥性腸炎[12]等疾病。本研究結果顯示，小鼠食用復合益生菌固體飲料30 d后，中劑量組已可使糞便腸球菌和腸桿菌菌落數較食用前均明顯降低，并且腸球菌菌落數下降趨勢還呈現劑量遞增效應，同時高劑量組小鼠糞便產氣莢膜梭菌菌落數較食用前顯著減少。對于腸道有益菌，低劑量組小鼠糞便雙歧桿菌菌落數較食用前顯著增加。按照《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）中調節腸道菌群功能檢驗方法的要求進行結果判定，復合益生菌固體飲料具有調節腸道菌群功能，可抑制致病菌生長，促進優勢菌增殖。本文研究結果與郎春輝等[13]的報道基本一致，嗜酸乳桿菌NCFM和乳雙歧桿菌HN019聯用可抑制小鼠腸道致病菌數量，增強對外來有害微生物定植的阻抗力，對機體健康有保護作用。

益生菌抑制有害菌生長主要存在以下3個方面的作用機制[14-15]。①與病原菌競爭營養物質和黏附位點，抑制其在腸道組織的黏附和定植。②酵解腸道不易吸收食物，代謝短鏈脂肪酸，形成酸性微環境，抑制病原體生長。③釋放抗菌肽，破壞病原菌細胞膜和細胞內結構。王韻婷等[16]研究結果也表明長雙歧桿菌BB536聯合乳雙歧桿菌HN019益生菌制劑可提高乙酸、丙酸和丁酸3種短鏈脂肪酸含量，改善腸道微環境。此外，INTURRI等[17]使用瓊脂孔擴散和肉湯微稀釋方法對益生菌抗菌活性進行了體外研究，發現長雙歧桿菌BB536和鼠李糖乳桿菌HN001對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和念珠菌具有抑制作用。綜上所述，本研究復合益生菌固體飲料可對小鼠腸道正向調節，增加有益菌的增殖，同時抑制有害菌生長。本次研究進一步探究了益生菌在腸道中的作用，為調理腸道菌群功能食品的開發與研究提供幫助，但對其調節腸道菌群的機制尚未完全清楚，待進一步探究。