恩施地區常見乳菇類野生菌分子鑒定及系統發育分析

韓 玉，吳 堯，揭春玉，王 林，吳雙清

（恩施土家族苗族自治州農業科學院，湖北 恩施 445000）

乳菇屬（Lactarius）為擔子菌亞門層菌綱傘菌目紅菇科真菌，常與樹木如馬尾松、松樹、云杉等形成外生菌根，大多為食用菌，味道鮮美，具有較高的營養價值和醫用價值［1，2］。利用分子生物學技術將乳菇類真菌歸為Lactarius、Lactifluus、Multifurca3 個屬［2］。

湖北省恩施土家族苗族自治州（以下簡稱恩施）地處武陵山區，是天然野生菌生長繁殖的理想場所。每年6—10 月，有一種被老百姓稱為“樅樹菌”的乳菇菌大量生長，該乳菇菌味道鮮美，但因為相似菌株多，農民鑒別能力不強，常造成誤采誤食。鑒于中毒現象增多及生態環境保護政策，政府大力宣傳保護自然生態系統，禁止兜售野生菌，因此，對當地特色資源的調查和開發利用成為迫切需要解決的問題。

當前，恩施地區野生菌種類的相關報道較少。為詳細了解當地常見乳菇屬野生菌的特性，本研究從分子生物學水平分析恩施地區菌株種類及其遺傳多樣性。近年來ITS 廣泛應用于乳菇菌、羊肚菌、木耳等其他食用菌的遺傳多樣性檢測和分析上［3-6］，本研究亦采用ITS 序列分析法對恩施地區常見乳菇屬野生菌進行分析鑒定，以期為當地生態資源保護和篩選優良可食用野生菌提供理論依據，同時促進野生菌馴化栽培進程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 在生長季節，收集恩施不同地點、不同時期的樣品于自封袋內，標記時間、地點后置于裝有冰袋的冷藏箱中，帶回實驗室進行處理和分離培養（表1）。

表1 菌株編號及來源

1.1.2 主要試劑 2×TaqPCR StarMix with Loading Dye，北京康潤誠業生物科技有限公司；4S Green Plus 無毒核酸染料，生工（上海）股份有限公司；50×TAE Buffer，提取DNA 試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 HH-4 型恒溫水浴鍋，金壇科興儀器廠；VoRTEX-5 型振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Centrifuge 5424R 型微量冷凍離心機，德國艾本德公司；Biometra TRIO 48 型PCR 儀，德國耶拿公司；DYY-6D 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Gel DocXR+型凝膠成像系統，美國伯樂公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 采用CTAB 法。

1.2.2 ITS 區段的擴增及測序 用生工（上海）股份有限公司合成的ITS1 和ITS4 通用引物對目的基因進行PCR 擴增，擴增體系（50 μL）：2×TaqMaster Mix（with Dye）25 μL，DNA 1 μL，10 μmol/L ITS1 2 μL，

10 μmol/L ITS4 2 μL，ddH2O 20 μL。反 應 程 序：94 ℃預變性，94 ℃變性1 min；55 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min 30 s，循環35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 測序分析 將PCR 產物送至生工（上海）股份有限公司進行正向測序。測得序列在GenBank 核酸數據庫中進行BLAST 比對，根據相似性由高到低進行排列選取最近同源物。借助MEGA 5.0 軟件將所有需要比對的序列采用鄰接法構建系統發育樹并進行遺傳距離分析。外類群有紅菇屬（Russula vinosa）（AF418638.1）和 乳 菇 屬（Lactarius vividus）（KT163432.1）2 種。

2 結果與分析

2.1 PCR 擴增及電泳檢測結果

PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，均能得到目的條帶，條帶清晰，片段長度約750 bp（圖1）。

圖1 菌株PCR 電泳結果

2.2 ITS 序列比對分析

根據比對結果，發現24 份菌株樣品中有17 份與Lactarius vividus相似；3 份與Lactarius salmonicolor相似；3 份與Lactarius hatsudake相似；1 份與Lactifluus pilosus相似，相似性均達99%～100%（表2）。

表2 菌株ITS 序列BLAST 比對結果

2.3 系統發育樹分析

由圖2 可知，S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S22 和S23 與Lactarius vividus聚為一支（支持率為100%），S15 和S23 又分別形成一個小分支，說明這些菌株在系統發育學分類上為鮮艷乳菇；由圖3 可知，菌株S6、S17 和S21 與Lactarius salmonicolor聚為一支，支持率為65%，說明它們可能存在地理隔離，導致菌株間可信度不高；由圖4 可知，菌株S18、S19 和S20 與Lactarius hatsudak、Lactarius akahatsu（MN258654.1）和Lactarius deterrimus（MZ158281.1）聚為一支（支持率為59%），但S18、Lactarius akahatsu和Lactarius deterrimus都存在較長的分支，說明菌株S18、S19 和S20 可能都為紅汁乳菇，但是其親緣關系較比對的樣品更遠，是否與地理隔離有關，仍需大量的試驗數據證明；由圖5 可知，菌株S24 與Lactifluus pilosus聚為一支，支持率為97%，證明S24 為長絨多汁乳菇。

圖2 S1、S2、S3 等系統進化樹

圖3 S6、S17 和S21 系統進化樹

圖4 S18、S19 和S20 系統進化樹

圖5 S24 系統進化樹

2.4 部分樣品遺傳距離分析

為了進一步鑒定所測菌株的特性，對采集的樣akahatsu、Lactarius deterrimus遺傳距離相對較遠；S24 與聚為一支的Lactifluus pilosus（MZ157882.1）遺傳距離為0。品與其聚為一支的菌株進行遺傳距離分析（表3），發 現S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S16 和S22 與3 個最近的Lactarius vividus遺傳距離為0，而S15 和S23 與同源物存在一定的遺傳距 離；S6、S17 和S21 均 與Lactarius salmonicolor（JX852629.1）遺傳距離為0；S19 和S20 與Lactarius hatsudake遺傳距離為0，而S18 與Lactarius hatsudake存在一定的遺傳距離，S18、S19 和S20 均與Lactarius

表3 遺傳距離

綜合以上結果可知，S1、S2、S3、S4、S5、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S22 和S23 為鮮艷乳菇；S6、S17 和S21 為鮭色乳菇；S18、S19 和S20為紅汁乳菇；S24 為長絨多汁乳菇。部分樣品在系統發育分析中與最近同源物之間存在一定的差異，可能是因為地理隔離造成的。

3 小結與討論

24 份恩施地區常見的乳菇類菌株資源樣品均采用ITS 序列分析法和GenBank 數據庫比對進行鑒定，結果表明，有17 份樣品為鮮艷乳菇、3 份為鮭色乳菇、3 份為為紅汁乳菇，1 份為長絨多汁乳菇，與相關形態學描述相同［7，8］。說明恩施地區常見的野生食用菌主要以鮮艷乳菇為主，還有少量的鮭色乳菇和紅汁乳菇，但各菌株之間存在一定的差異，可能與地理隔離有關。在野生食用菌的生長采摘期，存在一些有毒菌，最易混淆的就是本試驗采集鑒定的長絨多汁乳菇，其屬于水乳菇屬（Lactifluus），食用后可導致胃腸中毒［9，10］。有關長絨多汁乳菇的報道較少，恩施更是首次報道。恩施地區野生菌種類繁多，在當地被稱為“樅樹菌”的野生菌實則包含多個品種，同時部分有毒野生菌形態特征與其非常相近，人們不易辨別，每年都有多起中毒事故發生。本研究收集的樣品有限，是否有未收集到的資源有待進一步取樣鑒定。下一步將增加取樣點，獲得更深入的研究數據，以期利用當地特色資源，對適合當地生長的野生食用菌進行馴化和改良，發展食用菌產業，滿足人們對特殊食用菌的需求，為鄉村產業振興貢獻力量。