亞麻薺FUS3轉錄因子的鑒定及功能分析

羅 濤，王計平，高慧玲，崔紅利，李潤植

(山西農業大學 分子農業與生物能源研究所，山西太谷 030801)

亞麻薺屬于十字花科亞麻薺屬一年生草本植物，被認為是保健食用油和生物柴油的優質原料[1]。與其他油料作物相比，亞麻薺在生長周期(約90 d)以及抗逆方面具有明顯優勢[2]。更為重要的是，亞麻薺作為一種古老而又富含研究價值的環境友好型油料作物，其種子含油量較高(種子干重的36%～47%)，而且富含多不飽和脂肪酸(PUFA)，其中亞油酸(C18:2)約占總含油量的19%，亞麻酸(C18:3)約占32%[3]。植物油脂合成途徑主要包括在質體中的從頭合成以及內質網上的加工和組裝過程[4-5]，轉錄因子可以通過結合順式作用元件調控下游基因表達，從而調控物質合成與代謝過程。

近年來，轉錄因子的功能研究越來越多，包括在非生物脅迫[6]、代謝物質積累[7-9]及生長發育[10]等方面。LAFL基因(包括LEC1、LEC2、ABI3和FUS3)調控種子發育的不同階段，包括胚胎發生和貯藏物質的積累[11-12]。FUS3是可以調控油脂合成基因的植物特異性轉錄因子之一，它包含一個B3結構域，該結構域能特異性結合RY元件[13]，調控下游基因的轉錄表達。有研究發現，過表達LEC1可以增加擬南芥幼苗的油脂積累，而在FUS3突變體中，LEC1的表達并沒有導致油脂含量的明顯增加，這說明LEC1的功能部分依賴于FUS3[14]；對擬南芥FUS3突變體的研究還發現，擬南芥FUS3突變體中總脂肪酸含量為野生型含量的31%，與ABI3(62%)和LEC2(79%)突變體相比變化更顯著，由此說明FUS3在擬南芥油脂積累方面發揮重要調控作用[15]。Elahi等[16]在油菜FUS3突變體中同樣發現FUS3能調控油脂的積累；Zhang等[17]過表達FUS3后，激活了煙草BY2細胞和擬南芥幼苗中的TAG生物合成，當FUS3和DGAT1共表達時，又進一步增加了煙草BY2細胞的油脂積累。另外，在擬南芥FUS3突變體中，油酸(C18:1)的去飽和效率較野生型明顯降低，并且FUS3在一定程度上也調控超長鏈脂肪酸的積累[15]。這些研究結果均表明FUS3在調控油脂合成與積累過程中發揮重要作用。

本研究利用生物信息學方法及RT-PCR技術分析鑒定了亞麻薺CsFUS3-1和CsFUS3-2基因，并預測其互作蛋白及下游表達基因，利用實時熒光定量PCR檢測CsFUS3基因的時空表達模式，并通過異源表達鑒定CsFUS3基因的功能。該研究為深入解析亞麻薺高油含量的分子機制提供新知識，同時，為進一步篩選和培育優良油料作物新品種提供新的基因元件和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料亞麻薺(SC-N1)種植于山西農業大學試驗田。試驗所用的組織材料(根、莖、葉)取自亞麻薺8～10片真葉的幼苗，花取自亞麻薺盛花期，于亞麻薺花后10、20、30、40 d采集種子。各試驗材料采集后液氮速凍，存放于-80 ℃超低溫冰箱。

煙草種子、農桿菌感受態細胞(GV3101)均由分子農業與生物能源研究所提供。pCAMBIA3300載體購買自淼靈質粒平臺。

1.2 方 法

1.2.1 CsFUS3家族的鑒定及生物信息學分析利用AtFUS3蛋白序列作為種子序列，在亞麻薺基因組庫中進行Blastp篩選，初步篩選出2條亞麻薺CsFUS3蛋白序列，分別命名為CsFUS3-1和CsFUS3-2。利用CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)、PFAM(https://pfam.xfam.org/)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對兩條候選序列進行功能結構域分析。

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線數據庫分析CsFUS3蛋白序列的基本理化性質；利用在線工具對CsFUS3蛋白進行亞細胞定位(https://psort.hgc.jp/form2.html)、信號肽(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)和跨膜區(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預測分析；分別利用在線網站SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對CsFUS3蛋白序列進行二級和三級結構預測；運用在線網站GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/)分析CsFUS3的基因結構。

利用DNAMAN對AtFUS3和CsFUS3進行多序列比對分析；運用MEGA7.0對亞麻薺CsFUS3以及其他物種的FUS3蛋白序列(表1)進行系統進化分析，方法為鄰接法(Neighbor-joining method)；利用在線工具MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對CsFUS3蛋白家族進行保守結構預測分析；利用TBtools提取亞麻薺CsFUS3基因上游2 000 bp的啟動子區序列，利用Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對其進行順式作用元件預測分析。

表1 各物種FUS3蛋白序列信息

1.2.2 CsFUS3互作蛋白預測為了獲得亞麻薺CsFUS3蛋白與其他蛋白之間的互作關系，通過在線網站STRING(https://cn.string-db.org/)進行互作蛋白預測，最小相互作用分值設置為0.7。

1.2.3CsFUS3下游基因預測為研究CsFUS3參與亞麻薺油脂合成的調控機制，進一步分析了油脂合成相關基因的上游啟動子序列。根據CsFUS3特異性結合RY元件特性[13]，篩選CsFUS3可能調控的下游基因；再從亞麻薺轉錄組數據[18]中提取這些下游基因在不同發育時期種子中的轉錄表達數據(FPKM)進行相關性分析，并繪制折線圖，分析CsFUS3基因與下游基因的共表達模式。

1.2.4CsFUS3基因的表達模式分析利用試劑盒(9109, TaKaRa)提取亞麻薺不同組織(根、莖、葉、花及不同發育時期的種子)的總RNA，利用反轉錄試劑盒(RR047A, TaKaRa)將提取的總RNA反轉錄成cDNA。用Primer 6.0軟件設計CsFUS3基因特異性引物，以亞麻薺CsActin作為內參基因(表2)，對CsFUS3基因進行RT-PCR分析；用試劑盒(RR820A, TaKaRa)進行qRT-PCR檢測，每個樣品設置3次重復。采用2-△△Ct計算基因的相對表達量，用SPSS 25.0軟件進行顯著性分析。

表2 引物信息

1.2.5 煙草瞬時表達表達載體pCAMBIA3300-CsFUS3-1和pCAMBIA3300-CsFUS3-2由蘇州金唯智生物科技有限公司構建。利用試劑盒(9760，TaKaRa)提取質粒，將提取的質粒通過熱激法轉入根癌農桿菌，用引物F(TGTAAAACGACGGCCAGT)和R(CAGGAAACAGCTATGACC)檢測后，配制煙草侵染液，用注射器侵染煙草葉片。取侵染3 d后的葉片提取RNA，檢測目的基因是否有效表達，所用CsFUS3基因引物見表2，煙草內參基因NtActin引物為F(CAGTGGCCGTACAACAGGTA)和R(AACCGAAGAATTGCATGAGG)。取侵染5 d后的葉片冷凍干燥，保存備用。

1.2.6 總油脂的提取和測定采用氯仿-甲醇法提取煙草葉片的總油脂。稱取50 mg粉末，加7.5 mL甲醇:氯仿(2∶1)，置于37 ℃搖床振蕩反應24 h，離心收集上層有機相。沉淀再用7.5 mL甲醇∶氯仿(2∶1)抽提2 h，收集上層有機相。將收集的上層有機相合并，加入5 mL氯仿和9 mL 1% NaCl溶液，使體系中甲醇∶氯仿∶1% NaCl溶液體積比為2∶2∶1.8，混勻后離心。吸取下層清液于稱重后的玻璃管(W1)中，氮吹儀吹干后，置于真空干燥箱中4 h，稱重(W2)。總油脂含量=(W2-W1)/0.05。

2 結果與分析

2.1 亞麻薺CsFUS3蛋白的理化性質分析

利用AtFUS3蛋白序列進行本地Blast，鑒定出2條亞麻薺CsFUS3蛋白序列，均與擬南芥AtFUS3屬于B3蛋白家族，分別命名為CsFUS3-1和CsFUS3-2，蛋白長度分別為310和311個氨基酸，分子量分別為34.98和35.03 kD，理論等電點分別為5.65和5.55，均為酸性蛋白。CsFUS3-1和CsFUS3-2蛋白不穩定指數各為45.43和45.57，均屬于不穩定蛋白。2個CsFUS3蛋白均無跨膜區和信號肽，不屬于分泌蛋白。通過亞細胞定位發現，2個CsFUS3蛋白與擬南芥AtFUS3均位于細胞核。經比較CsFUS3和AtFUS3蛋白的理化性質基本一致(表3)。

表3 亞麻薺CsFUS3基因及編碼蛋白的基本信息

2.2 CsFUS3基因及編碼蛋白結構預測

基因結構(圖1)比較發現，CsFUS3和AtFUS3基因的結構相似，3個基因均含有6個外顯子，其中CsFUS3-1和AtFUS3包含5個內含子，而CsFUS3-2除了編碼區含有5個內含子外，5′端非編碼區還存在1個內含子。

圖1 亞麻薺CsFUS3與擬南芥AtFUS3基因結構比較Fig.1 Gene structure of CsFUS3 from C. sativa and AtFUS3 from Arabidopsis thaliana

二級結構預測(圖2)發現，亞麻薺CsFUS3-1蛋白的二級結構包括無規則卷曲47.42%、α-螺旋29.35%、延伸鏈17.1%和β-轉角6.13%；CsFUS3-2蛋白的二級結構包括無規則卷曲45.98%、α-螺旋26.37%、延伸鏈18.65%和β-轉角9%。2個CsFUS3蛋白與擬南芥AtFUS3的二級結構組成(無規則卷曲46.96%、α-螺旋27.48%、延伸鏈19.17%、β-轉角6.39%)類似，其中無規則卷曲的占比最高，其次是α-螺旋和延伸鏈，而β-轉角占比最小。3個FUS3蛋白的二級結構相似，只是在各組成結構占比上存在一定差異。

圖2 亞麻薺CsFUS3與擬南芥AtFUS3蛋白的二級結構比較Fig.2 Secondary structure of CsFUS3 proteins from C. sativa and AtFUS3 protein from A. thaliana

對CsFUS3與擬南芥AtFUS3蛋白進行同源建模比較(比對模板編號：5z00.1.C)，結果見圖3，CsFUS3-1和CsFUS3-2的序列相似度分別為0.4和0.41，覆蓋度均為0.35，都是以同源四聚體形式發揮作用。與AtFUS3蛋白一樣，構成CsFUS3蛋白的多肽鏈不存在配體。

圖3 亞麻薺CsFUS3與擬南芥AtFUS3蛋白的三級結構比較Fig.3 Tertiary structure of CsFUS3 proteins from C. sativa and AtFUS3 protein from A. thaliana

2.3 CsFUS3蛋白的多序列比對、系統進化及保守基序分析

與AtFUS3蛋白進行序列比對(圖4)發現，2個CsFUS3與AtFUS3蛋白序列相似性極高，均包含一個高度保守的B3結構域。系統進化分析(圖5，A)發現，各物種的FUS3蛋白大致分為三類，CsFUS3蛋白與擬南芥、白菜型油菜、蓖麻和麻風樹FUS3聚類于同一分支，且CsFUS3與擬南芥AtFUS3的親緣關系最近，可能具有相同的進化來源。

圖4 亞麻薺CsFUS3與擬南芥AtFUS3蛋白序列比對Fig.4 Multiple sequence alignment of CsFUS3 proteins of C. sativa and AtFUS3 protein from A. thaliana

在MEME網站進行保守結構域(圖5，B)預測分析，發現亞麻薺CsFUS3與同屬于十字花科的擬南芥和白菜型油菜FUS3具有相同的保守域且分布一致。與其他物種的FUS3蛋白相比，十字花科植物的FUS3中包含獨有的motif 8，該motif可能是十字花科物種FUS3蛋白在進化上的關鍵氨基酸殘基位點。

AtFUS3. 擬南芥；BrFUS3a、BrFUS3b. 白菜型油菜；RcFUS3. 蓖麻；JcFUS3. 麻風樹；AhFUS3. 花生；GmFUS3a、GmFUS3b. 大豆；GsFUS3. 野大豆；HvFUS3. 大麥圖5 各物種FUS3蛋白的系統進化樹和保守基序分析AtFUS3. Arabidopsis thaliana；BrFUS3a, BrFUS3b. Brassica rapa；RcFUS3.Ricinus communis；JcFUS3. Jatropha curcas；AhFUS3. Arachis hypogaea；GmFUS3a, GmFUS3b. Glycine max；GsFUS3. Glycine soja；HvFUS3. Hordeum vulgareFig.5 Phylogenetic tree and conserved motif analysis of FUS3 proteins from various species

2.4 CsFUS3啟動子元件分析

提取CsFUS3基因上游2 000 bp序列進行啟動子元件分析，結果見表4，兩個CsFUS3基因包含相同的功能元件，分別是啟動子基本元件CAAT-box和TATA-box、參與胚乳特異性負表達元件、參與防御和應激反應的順式作用元件、厭氧誘導所必需的順式調節元件、光響應元件、與光反應有關的MYB結合位點和α-淀粉酶啟動子保守序列。

表4 亞麻薺CsFUS3基因上游啟動子順式作用元件

2.5 CsFUS3與油脂合成相關蛋白的互作分析

利用STRING在線數據庫進行互作蛋白預測發現(圖6)，CsFUS3與WRI1、AGL15、ABI5和BBM蛋白之間存在互作關系。WRI1在脂肪酸合成途徑中發揮重要作用[19]，而另外3個蛋白主要與植物的生長發育調控相關[20-23]。

圖6 亞麻薺CsFUS3與相關蛋白間的相互作用網絡Fig.6 Interaction network between CsFUS3 and related proteins in C. sativa

2.6 CsFUS3的組織表達特異性

為了探究CsFUS3基因在亞麻薺各組織中的功能，分別檢測了2個CsFUS3基因在亞麻薺的根、莖、葉、花以及不同發育時期的種子中的表達量，發現CsFUS3基因僅在種子中表達(圖7)，并且隨著種子的發育成熟，CsFUS3-1和CsFUS3-2基因表達量均呈現先增高后降低的變化趨勢，在花后30 d基因表達量達到最高，隨后逐漸降低。

不同小寫字母表示在P< 0.05水平上差異顯著圖7 亞麻薺CsFUS3基因表達分析Different normal letters indicate significantly different at P < 0.05Fig.7 Expression analysis of CsFUS3 genes of C. sativa

2.7 CsFUS3下游靶基因預測

根據CsFUS3特異性結合RY元件的特性，對油脂合成相關基因的上游啟動子進行分析，發現6個可能的靶基因(表5)。轉錄組數據顯示，這些基因在種子中特異性表達。根據OLE1、OLE2、OLE3、ABI3-1、ABI3-2和ABI3-3基因在不同發育時期的種子中的FPKM值，預測其與CsFUS3基因的共表達模式，結果如圖8所示，4個基因(OLE1、OLE2、OLE3和ABI3-3)與CsFUS3基因的表達量變化趨勢顯著相關(P<0.01)，在花后30 d時表達量均達到最高。因此，推測在亞麻薺種子發育時期CsFUS3直接調控OLE1、OLE2、OLE3和ABI3-3基因的轉錄表達。

表5 預測基因在亞麻薺數據庫中的編號

圖8 預測基因在亞麻薺不同發育時期種子中的FPKM變化趨勢Fig.8 FPKM variation trend of predicted genes at different seed developmental stages of C. sativa

2.8 過表達CsFUS3促進煙葉總油脂含量積累

為解析CsFUS3是否具有調控油脂合成的功能，分別構建植物表達載體pCAMBIA3300-CsFUS3-1和pCAMBIA3300-CsFUS3-2(圖9，A)，通過雙酶切驗證(圖9，B、C)載體正確后，轉化根癌農桿菌，得到陽性單克隆(圖9，D、E)。利用農桿菌介導煙草葉片瞬時表達CsFUS3基因，侵染3 d后，提取葉片RNA，RT-PCR檢測顯示，CsFUS3-1和CsFUS3-2基因在煙草葉片中有效表達(圖10)。

A. 植物重組表達載體示意圖； B～C. 載體雙酶切驗證：M. DL2000；1. pCAMBIA3300-CsFUS3-1(B)和pCAMBIA3300-CsFUS3-2(C)；2. 雙酶切；D～E. 農桿菌轉化：M. DL5000；1. 農桿菌陽性單克隆，pCAMBIA3300-CsFUS3-1(D)和pCAMBIA3300-CsFUS3-2(E)圖9 植物重組表達載體構建及驗證A. Schematic diagram of plant recombinant expression vector；B-C. Double restriction enzyme digestion verification of vector: M. DL2000；1. pCAMBIA3300-CsFUS3-1(B) and pCAMBIA3300-CsFUS3-2(C)；2. Double digested； D-E. Detection of Agrobacterium transformants： M. DL5000；1. The positive Agrobacterium clones，pCAMBIA3300-CsFUS3-1(D) and pCAMBIA3300-CsFUS3-2(E)Fig.9 Construction and verification of plant recombinant expression vector

M. DL1000；A. 煙草內參基因RT-PCR檢測： 1、2. CsFUS3-1轉基因葉片；3、4. CsFUS3-2轉基因葉片；B. CsFUS3-1基因RT-PCR檢測；C. CsFUS3-2基因RT-PCR檢測圖10 煙草葉片瞬時表達RT-PCR檢測M. DL1000；A. RT-PCR detection of tobacco reference genes：1,2. CsFUS3-1 transgenic leaves；3,4. CsFUS3-2 transgenic leaves；B. RT-PCR detection of CsFUS3-1；C. RT-PCR detection of CsFUS3-2Fig.10 RT-PCR detection of transient expression in tobacco leaves

選取野生型及轉CsFUS3-1和CsFUS3-2基因的煙草葉片進行總油脂含量測定。結果顯示(圖11)，與野生型相比，轉CsFUS3-1和CsFUS3-2基因的葉片總油脂含量分別提高了0.95%和1.12%，但差異不顯著。

不同小寫字母表示在P< 0.05水平上差異顯著圖11 過表達CsFUS3基因的煙葉總油脂含量Different normal letters indicate significantly different at P < 0.05Fig.11 Total oil content in tobacco leaves overexpressing CsFUS3 genes

3 討 論

3.1 CsFUS3基因序列結構特征及高度保守性

FUS3是一類植物特異性轉錄因子，僅存在于種子植物中[24-25]，并在種子成熟過程中發揮作用[26]。目前對該基因的研究主要在擬南芥[27-29]、油菜[16,30]和花生[31]等植物中，而亞麻薺FUS3基因的研究鮮有報道。本研究利用AtFUS3蛋白序列，在亞麻薺基因組數據庫中鑒定出2條完整的CsFUS3蛋白序列，這兩條序列均包含一個B3結構域，屬于B3家族蛋白[32]。系統發育顯示CsFUS3與同屬十字花科的擬南芥和白菜型油菜AtFUS3蛋白親緣關系最近，并且這些蛋白包含的保守基序高度一致，說明FUS3蛋白的進化高度保守。

亞麻薺CsFUS3基因啟動子區涉及到參與胚乳特異性調控、防御和應激反應、厭氧誘導和光響應元件，以及MYB結合位點和α-淀粉酶啟動子保守序列。眾多調控因子參與植物細胞胚胎發育，其中包括FUS3[33]，如韋云婷等[30]對甘藍型油菜分析發現，FUS3對胚胎發育具有重要作用；另有研究表明，與MYB有關的一些結合元件大多與植物的干旱反應相關[34]，在甘藍型油菜中BnaFUS3可以響應多種非生物脅迫[35]；推測亞麻薺CsFUS3基因可能響應逆境脅迫，并參與植物胚胎發生過程。

3.2 CsFUS3在亞麻薺種子中特異表達

本研究發現，CsFUS3基因在亞麻薺種子中特異性表達，并在種子的四個發育時期中表達量呈先升高后降低的趨勢，與花生和油用牡丹種子中FUS3基因的表達模式相同[31,36]。CsFUS3基因在亞麻薺種子發育中后期的表達量最高，推測CsFUS3基因在該時期通過調控相關基因表達來控制種子中油脂的合成與積累。

3.3 CsFUS3基因調控網絡

在擬南芥中，由LEC1、ABI3、FUS3和LEC2組成的LAFL調控網絡，是激活種子發育成熟的主調控因子[15]。FUS3基因直接作用ABI3參與種子儲藏蛋白和油體蛋白的合成[29]。FUS3與質體脂肪酸生物合成基因的轉錄表達也表現出一定的誘導關系[37]。本研究結果推測，CsFUS3直接調控ABI3-3和OLE基因表達促進種子TAG積累。

互作蛋白預測分析發現，CsFUS3與WRI1蛋白相互作用參與種子油脂合成調控，FUS3與AGL15、BBM、ABI5蛋白之間的互作，可能在植物胚胎發生、種子發育等方面發揮重要作用[4,29]。

3.4 CsFUS3基因促進煙草葉片油脂積累

本研究構建植物表達載體，在煙草葉片中異源表達CsFUS3-1和CsFUS3-2基因，發現轉基因葉片中總油脂含量比野生型高，但差異不顯著，表明CsFUS3基因可能會促進細胞油脂合成積累，我們將進一步轉化亞麻薺及擬南芥驗證其功能。