套袋蘋果果實質地及其顯微結構與果面裂紋的關系

黃晶淼，王金鑫，李建明，索相敏，郝 婕，李學營

(河北省農林科學院石家莊果樹研究所，石家莊 050061)

中國蘋果(Malusdomestica)產量居世界首位[1]，河北省作為蘋果主產區之一，富士系蘋果占栽培面積的70%左右，產量占62.29%。但是，河北平原區經常出現蘋果果實裂紋現象，主要表現在果實成熟前，其果肩部、胴部、萼洼部易出現網狀或波紋狀的褐色裂紋，不僅影響果實外觀品質，而且也會成為病原菌侵害果實的途徑之一，引起其他病害，導致果實腐爛，貨架期縮短，市場競爭力降低、果農收入削減[2]。果實裂紋現象在櫻桃、棗、石榴等果樹上也均有發生[3-5]，其誘發因素包括氣候環境、果園管理、果實表型特征、遺傳等，即使在相同果園管理和環境條件下，不同品種果實易裂程度與果實的硬度、果皮強度、角質膜性質之間也存在一定相關性[6]。

目前，蘋果果實裂紋的研究多集中于針對一個品種，外施赤霉素、細胞分裂素等生長調節劑及Ca2+抑制劑對裂紋的調控作用[7-8]，或果膠含量和相應酶活性、擴展蛋白基因表達在果實成熟過程中的變化[9-10]，多個不同易裂度品種間相關指標的比較鮮有報道。有研究表明，果實質地及組織力學性能與果實裂紋密切相關[11-12]。質構儀能客觀、準確地描述蘋果果實質地[13]。本研究以親緣關系較近、果實易裂程度不同的蘋果品種(系)作為兩組試驗材料，利用質構儀測定果實質地，同時利用光學顯微鏡觀察果實顯微結構，采取主成分結合灰色關聯度分析果實質地、顯微結構與裂紋之間的關系，以期為蘋果裂紋的形成機制探討及抗裂紋品種的選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為栽植于同一果園、套白色單層紙袋、果面裂紋程度不同的4個蘋果品種(系)：著色富士系‘天紅2號’和短枝富士后代優系4-1-103，不著色姊妹系‘冀蘋4號’和‘冀蘋5號’。每個品種(系)分別選擇3株生長發育狀況良好且長勢一致的樹，從盛花后132 d起，每隔8～13 d調查1次果實裂紋發生情況。于盛花后185 d從每株試驗樹上采集3個果實帶回實驗室4 ℃保存備用，果實狀態如圖1所示。

A.天紅2號；B.4-1-103；C.冀蘋4號；D.冀蘋5號圖1 不同品種(系)蘋果盛花后185 d果實A. Tianhong 2; B. 4-1-103; C. Jiping 4; D. Jiping 5Fig.1 Fruits of different apple cultivars (series) on 185 days after full bloom

1.2 測定指標及方法

1.2.1 果實裂紋率和裂紋指數每個品種(系)隨機掛牌固定100個果實，觀察果肩部、胴部、萼洼部裂紋發生情況并分級。分級標準：果面光滑，未出現裂紋為0級，果面裂紋面積占總面積<10%為1級，10%～20%為2級，20%～40%為3級，40%～60%為4級，>60%為5級[14]。依據調查結果按照如下公式計算裂紋率和裂紋指數。

裂紋率=裂紋的果數/調查總果數×100%

裂紋指數=∑(各級裂紋果數×裂紋級數)/(調查總果數×最高級數)

1.2.2 果實質地用美國Food Technology Corporation公司生產的TMS-PRO質構儀測定果實質地，于盛花后185 d，每株試驗樹隨機選取3個果實，每個果實陰陽面各測1次。選用P/2柱狀探頭(直徑2 mm)，從果肩處進行整果穿刺法測定果皮破裂前形變量、果皮硬度、果肉硬度等，儀器參數為：試驗測試速度100 mm/min，觸發力0.50 N，穿刺距離10.00 mm[15]。用直徑為1.50 cm的打孔器在果肩處打孔，切取高度為5.00 mm的果肉圓柱體，選用P/75探頭(直徑75 mm)，質地多面分析法(texture profile analysis，TPA)測定果肉脆裂性、硬度、彈性等，儀器參數為：力感應量程250 N，受壓形變量60%，測試速度60 mm/min，觸發力0.20 N[16]。

1.2.3 果實顯微結構在果肩部分別取果皮(長寬各5 mm)、果肉(長寬厚各5 mm)放入FAA固定液中固定24 h，制作石蠟切片，在Olympus光學顯微鏡下觀察、拍照[17-18]。采用ImageJ軟件測量角質膜厚度、表皮細胞面積、維管束直徑和果肉間隙率等指標。

1.3 數據統計與分析

利用Excel 2007進行數據統計，用SPSS 22.0進行方差分析，獨立樣本T檢驗和單因素ANOVA比較差異顯著性，用SPSSPRO進行主成分和灰色關聯度分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種(系)蘋果果實裂紋發生情況比較

2.1.1 裂紋率和裂紋指數由圖2可知，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’果實均于盛花后142 d開始出現裂紋，‘冀蘋5號’和4-1-103則分別于盛花后161 和174 d開始出現裂紋。在盛花后132～185 d，不同品種(系)蘋果果實裂紋率均有升高趨勢，且‘天紅2號’裂紋率始終明顯高于同期優系4-1-103，‘冀蘋4號’裂紋率始終明顯高于同期的姊妹系‘冀蘋5號’?！旒t2號’和‘冀蘋4號’裂紋高發期分別出現于盛花后150～185 d和142～174 d，均于盛花后185 d裂紋率達最大值，分別為81.82%和66.67%；4-1-103和‘冀蘋5號’裂紋率均于174 d才有明顯升高趨勢，最大值僅分別為2.50%和17.50%。

圖2 不同品種(系)蘋果果面裂紋率變化Fig.2 Changes of percentage of cracking in different apple cultivars (series)

同時，圖3顯示，在盛花后142～185 d，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’裂紋指數表現出升高的趨勢，分別由0.25、0.20增加至1.88、1.27；優系4-1-103在盛花后174 d為0.03，其余時間均為0，‘冀蘋5號’在盛花后174～185 d僅由0.27增加至0.30，其余時間均為0。在同一調查時間點，4-1-103和‘冀蘋5號’的裂紋指數分別顯著低于‘天紅2號’和‘冀蘋4號’?？梢?，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’果實裂紋出現早、裂紋指數高，而4-1-103和‘冀蘋5號’果實裂紋出現遲、裂紋指數很低。

*表示同期品種(系)間在0.05水平內存在顯著性差異(P<0.05)圖3 不同品種(系)蘋果果面裂紋指數變化*indicate significant difference between cultivars (series) during the same period at 0.05 level (P<0.05)Fig.3 Changes of cracking index in different apple cultivars (series)

2.1.2 不同部位裂紋變化由圖4可以看出，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’果肩部裂紋率始終高于胴部和萼洼部，均于盛花后185 d達最大值，分別為45.45%和61.11%?！旒t2號’萼洼部和胴部裂紋分別主要發生于盛花后142～161 d和161～185 d，裂紋率分別于161 d和185 d達最大值，分別為10.00%和31.81%?！教O4號’胴部于盛花后150 d出現裂紋，裂紋率于盛花后174 d達最大值(10.00%)，其萼洼部未發現裂紋。

圖4 ‘天紅2號’(A)和‘冀蘋4號’(B)果實不同部位裂紋率變化Fig.4 Changes of percentage of cracking in different parts of ‘Tianhong 2’(A) and‘Jiping 4’(B) fruit

2.2 不同品種(系)蘋果果實質地比較

由表1可知，整果穿刺法測試得到的果皮破裂前形變量、果皮硬度、果肉硬度、果皮果肉硬度比在‘冀蘋4號’與其低裂紋姊妹系‘冀蘋5號’之間均無顯著差異，果皮破裂前形變量在‘天紅2號’與其低裂紋優系4-1-103之間也無顯著差異，而其余3個指標均表現為‘天紅2號’顯著小于其低裂紋優系4-1-103。TPA得到的果肉彈性在各品種(系)之間均無顯著性差異，果肉脆裂性、硬度均表現為‘天紅2號’顯著小于低裂紋優系4-1-103，‘冀蘋4號’顯著小于其低裂紋姊妹系‘冀蘋5號’，即易裂紋品種果肉脆裂性和硬度均顯著小于不易裂紋品種。雖然，‘冀蘋4號’與‘冀蘋5號’ 果肉硬度在整果穿刺法中無顯著性差異，但在TPA中有顯著差異，且TPA能更精細地反映果肉質地差異，整果穿刺法是果肉質地的補充測定方式[19]。

表1 不同品種(系)蘋果果實質地特性

2.3 不同品種(系)蘋果果實顯微結構比較

2.3.1 果皮及果肉細胞的形態特征蘋果果實從外向內由角質膜細胞、表皮細胞和果肉細胞組成。從不同品種(系)蘋果果皮及果肉細胞的光學顯微結構圖(圖5)可以看出：角質膜呈透明狀態；表皮細胞位于角質膜與果肉細胞之間，有5～7層，靠近角質膜的表皮細胞呈長卵圓形，靠近果肉細胞的表皮細胞呈不規則圓形；內層的果肉細胞，比角質膜和表皮細胞大，其細胞間分布有維管束。不同品種(系)蘋果間果皮和果肉細胞形態亦存在明顯差異，易發生裂紋品種‘冀蘋4號’和‘天紅2號’角質膜有“V”型凹陷，深入表皮細胞，與其鑲嵌，并發生龜裂；表皮細胞排列疏松、無規則；果肉細胞間隙和維管束均較大。而不易發生裂紋品種(系)‘冀蘋5號’和4-1-103角質膜平滑且保存完整；表皮細胞排列緊實有規則，果肉細胞間隙和維管束相對較小。

2.3.2 果皮顯微結構不同品種(系)蘋果果皮顯微結構觀測結果(表2)顯示，‘冀蘋4號’表皮厚度顯著大于其低裂紋姊妹系‘冀蘋5號’，表皮細胞長寬比和表皮細胞密度均顯著小于‘冀蘋5號’；‘天紅2號’的角質膜厚度、表皮細胞長、表皮細胞長寬比和表皮細胞間隙率均顯著大于低裂紋優系4-1-103，而表皮細胞面積和表皮細胞密度則顯著小于4-1-103?？梢?，易裂紋蘋果品種果實表皮細胞密度顯著小于不易裂紋品種。

表2 不同品種(系)蘋果果皮顯微結構的指標比較

A-D.果皮；E-H.果肉；A、E.‘冀蘋4號’；B、F.‘冀蘋5號’；C、G.‘天紅2號’；D、H.4-1-103；1. 角質膜；2. 表皮細胞；3. 果肉細胞圖5 不同品種(系)蘋果果皮及果肉細胞的光學顯微結構A-D. Skin; E-H. Flesh; A,E.‘Jiping 4’; B,F.‘Jiping 5’; C,G.‘Tianhong 2’; D,H.4-1-103; 1. Cutin membrane; 2. Epidermal cell; 3. Flesh cellFig.5 Microstructure of skin and flesh cells in different apple cultivars (series)

2.3.3 果肉顯微結構由不同品種(系)蘋果果肉顯微結構的8個相關細胞指標(維管束直徑、維管束數量、果肉細胞密度和果肉細胞間隙率等)觀測結果(表3)可知，‘冀蘋4號’果肉細胞面積、細胞長、細胞寬和細胞間隙率均顯著大于其低裂紋姊妹系‘冀蘋5號’；‘天紅2號’果肉細胞間隙率和維管束直徑均顯著大于低裂紋優系4-1-103，果肉細胞面積和細胞寬均顯著小于4-1-103。說明易裂紋蘋果品種果肉細胞間隙率顯著大于不易裂品種。

表3 不同品種(系)蘋果果肉顯微結構的指標比較

2.4 蘋果果實質地和顯微結構與果肩裂紋指數關系

2.4.1 果實質地與果肩裂紋指數關系各品種(系)蘋果質地特性指標的主成分分析結果(表4)表明，前2個主成分因子方差累積貢獻率達89.750%，主成分1和2的特征根分別為3.347和2.935，即前2個主成分因子已經代表了全部指標的主要信息。其中，主成分1解釋了7個指標47.810%的變化，結合主成分因子載荷矩陣熱力圖(圖6)可明顯看出果肉硬度、TPA果肉硬度和果肉脆裂性因子載荷系數較高，是主成分1的主要相關指標；主成分2解釋了7個指標41.940%的變化，主要與果皮果肉硬度比相關。

表4 質地特性主成分因子載荷系數及方差貢獻率

圖6 質地特性主成分因子載荷矩陣熱力圖Fig.6 The heat map of principal component factor load matrix of texture characteristics

同時，將不同品種(系)蘋果質地特性指標與果肩裂紋指數進行灰色關聯度分析，結果(表5)顯示果皮破裂前形變量與果肩裂紋指數關聯度最高(0.990)，且果肉彈性、果皮果肉硬度比和果肉硬度3個指標與果肩裂紋指數的關聯度也均高于0.900，對果肩裂紋指數有較大影響力。兩種方法綜合分析結果表明，果肉硬度和果皮果肉硬度比是解釋果面裂紋的主要相關指標。

表5 質地特性與果肩裂紋指數灰色關聯度分析

2.4.2 果實顯微結構與果肩裂紋指數關系各品種(系)蘋果顯微結構指標主成分分析結果(表6)顯示，3個主成分因子方差累積貢獻率達100%，主成分1、2和3的特征根分別為7.366、5.756和2.878，3個主成分因子已經代表了全部指標的主要信息。其中，主成分1解釋了16個指標46.040%的變化，結合主成分因子載荷矩陣熱力圖(圖7)可明顯看出果肉細胞面積、果肉細胞寬和果肉細胞長因子載荷系數較高，是主成分1的主要相關指標；主成分2解釋了16個指標35.980%的變化，主要與果肉細胞間隙率和維管束直徑相關；主成分3解釋了16個指標17.990%的變化，主要與果肉細胞密度相關。

表6 顯微結構指標主成分因子載荷系數及方差貢獻率

圖7 顯微結構指標主成分因子載荷矩陣熱力圖Fig.7 The heat map of principal component factor load matrix of microstructure

同時，將不同品種(系)蘋果顯微結構指標與果肩裂紋指數進行灰色關聯度分析，結果(表7)表明果肉細胞間隙率、表皮細胞間隙率與果肩裂紋指數關聯度均達1.000，維管束數量、果肉細胞長寬比和表皮細胞長寬比3個指標與果肩裂紋指數關聯度均為0.999，它們對果肩裂紋指數均有較大影響力。兩種方法綜合分析表明，果肉細胞間隙率是解釋果面裂紋的主要相關指標。

表7 顯微結構指標與果肩裂紋指數灰色關聯度分析

3 討 論

果面裂紋主要發生在果實生長中后期[20]，不同品種之間易裂程度存在差異[21]。本研究中，‘天紅2號’和‘冀蘋4號’蘋果果面裂紋高發期分別在盛花后150～185 d和142～174 d，均為生長中后期；兩組試驗材料組內比較，‘天紅2號’出現裂紋的時間比優系4-1-103早32 d， ‘冀蘋4號’比其姊妹系‘冀蘋5號’早19 d；‘天紅2號’和‘冀蘋4號’裂紋出現時間早，持續時間長，發生程度較4-1-103和‘冀蘋5號’更嚴重。

Galvez等[22]認為即使親本及其后代個體或姊妹系間的果實質地也存在差異。本研究中，兩組試驗材料均為易裂紋品種的果肉脆裂性、果肉硬度顯著小于不易裂品種。有關棗裂果機制的研究中也表明，果肉硬度與裂果指數呈顯著負相關[12]。同時，本研究進一步的主成分結合灰色關聯度分析表明，果皮果肉硬度比是解釋蘋果果面裂紋的主要相關指標，吳建陽等[23]也認為果皮果肉力學強度不平衡，會導致果面裂紋的發生。

顯微結構差異性是果實裂紋的重點關注內容之一。魏欽平等[24]研究了不同地區‘喬納金’蘋果果皮解剖結構差異，發現果面光潔、低裂紋果實的角質膜不是最厚也不是最薄，認為角質膜厚度不是評價裂紋率的標準；而Fogelman等[25]通過研究‘粉紅女士’噴施赤霉素和細胞分裂素混合物后果實裂紋和細胞顯微結構，發現果面裂紋率降低、角質膜變厚，認為角質膜厚度與裂紋率呈負相關。本研究中，‘天紅2號’果實角質膜厚度顯著大于其優系4-1-103，但姊妹系‘冀蘋4號’和‘冀蘋5號’的角質膜厚度無顯著性差異，從而認為果實角質膜厚度與其裂紋率不是密切相關。魏欽平等[24]關注不同環境條件引起的果實裂紋差異，Fogelman等[25]觀察外施生長調節劑對一個品種果實裂紋的影響，本研究則比較不同品種間的果實裂紋差異，且試驗材料不同，因此材料和試驗自變量不同可能是導致結果不一致的原因。但研究結果普遍支持果實角質膜保存完整、平滑均一、不發生龜裂、無“V”型凹陷，且表皮及果肉細胞排列緊實有規則的品種較耐裂的觀點[26-27]。本研究中耐裂紋的品種(系)4-1-103和‘冀蘋5號’角質層完整，表皮和果肉細胞排列緊實，表皮細胞密度顯著大于易裂紋的‘天紅2號’和‘冀蘋4號’，果肉細胞間隙率顯著小于‘天紅2號’和‘冀蘋4號’。由此推測，細胞間隙率小，細胞密度大，細胞壁增加，引起鈣、果膠、纖維素和相應酶等細胞壁組分變化，從而增強了果實抗裂能力[10,23]，不同品種間細胞壁組分與裂紋的關系有待后續試驗驗證。

細胞間的空隙度和細胞形態特征對果肉硬度和脆度有很大程度的影響。本研究中，親緣關系較近的著色系‘天紅2號’和4-1-103，不著色姊妹系‘冀蘋4號’和‘冀蘋5號’兩組內比較，果實裂紋率與果肉脆裂性、硬度呈負相關，與果肉細胞間隙率呈正相關，果肉細胞間隙率與果肉脆裂性、硬度呈負相關，主成分和灰色關聯度分析也表明果肉硬度和細胞間隙率是解釋果面裂紋的主要相關指標，這與李紅光[28]和HOU等[29]的研究一致。但是，4個蘋果品種(系)同時比較發現，果實裂紋率表現為‘天紅2號’>‘冀蘋4號’>‘冀蘋5號’>4-1-103，果肉脆裂性和硬度表現為‘冀蘋5號’>‘冀蘋4號’>4-1-103>‘天紅2號’，果肉細胞間隙率表現為‘天紅2號’>‘冀蘋4號’>4-1-103>‘冀蘋5號’，并不是一一對應的正負相關，推測跟親本遺傳和果實著色有關[30]，今后需進一步研究果實連續發育過程中相關的酶和基因效應。

4 結 論

本研究通過觀察套白色單層紙袋著色富士系‘天紅2號’和短枝富士后代優系4-1-103，以及不著色姊妹系‘冀蘋4號’和‘冀蘋5號’4個蘋果品種(系)生長發育過程中裂紋率和裂紋指數變化，發現‘天紅2號’和‘冀蘋4號’果面裂紋率和裂紋指數始終高于4-1-103和‘冀蘋5號’，且其裂紋主要部位發生在果肩部。果實質地特性和顯微結構觀測結果顯示，易裂紋的‘天紅2號’和‘冀蘋4號’角質膜有“V”型凹陷，并發生龜裂；耐裂紋的4-1-103和‘冀蘋5號’角質膜完整，果肉脆裂性、果肉硬度和表皮細胞密度均顯著大于‘天紅2號’和‘冀蘋4號’，果肉細胞間隙率顯著小于‘天紅2號’和‘冀蘋4號’。主成分結合灰色關聯度分析發現，果肉硬度、果皮果肉硬度比和果肉細胞間隙率是解釋果面裂紋的主要相關指標。因此，果實角質膜完整均一、果肉硬度大、果肉細胞間隙率小的蘋果品種不易發生裂紋。