不同抗性泡核桃對褐斑病病原菌侵染的生理生化響應

王 芳，肖 玉，糜加軒，時羽杰，萬雪琴，楊漢波

(長江上游林業生態工程四川省重點實驗室，長江上游森林資源保育與生態安全國家林業和草原局重點實驗室，四川農業大學 林學院，生態林業研究所，成都 611130)

核桃是胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)所有種的種子的統稱，具有很高的營養價值和保健作用，在中國各地廣泛栽植[1-2]。泡核桃(Juglanssigillata)是核桃中的一種，是中國山區重要的經濟林樹種，主要種植于西南部及中部地區，該品種種植單一，管理粗放，病害問題日益嚴重[3]。褐斑病是危害核桃的三大病害之一，爆發性較強、遍布范圍極廣，而且嚴重危害核桃的葉片、嫩梢和果實，嚴重降低核桃產量和質量[4-5]。此外，使用化學藥品對核桃褐斑病進行防治會使病原菌產生抗藥性，也會污染環境，并且農藥殘留會增加食品風險。因此，采用抗病品種無疑是最安全有效的方法，培育和推廣抗病品種是防治褐斑病的最有效、最經濟的綠色途徑之一。而明確不同抗性核桃品種對褐斑病的抗性生理機制，對防治褐斑病的發生、品種利用以及制定有效的抗病育種策略具有重要意義。研究表明，植物遭受病原菌侵染后會產生大量活性氧(ROS)，抑制植物葉綠體發育，造成細胞膜脂過氧化，致使細胞死亡；為減輕ROS對細胞的損害，植物體內會發生復雜的生理生化反應，產生多種物質，清除體內過多的ROS，抵抗病原菌的入侵，增強植物的抗性[6-7]。這些物質包括過氧化物酶(peroxidase, POD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)等防御酶及非酶類物質(葉綠素、總酚等)，并且這些物質的變化與植物的抗病性有關[8-10]。例如，水稻遭受白發病侵染后，抗病品種中抗氧化酶活性及可溶性糖含量升高且顯著高于感病品種[11]；灰霉病侵染蘋果時抗病品種中類黃酮和木質素含量顯著高于感病品種[12]；抗病馬鈴薯抵抗瘡痂病侵染過程中POD和PPO活性逐漸升高，這兩種酶活性與馬鈴薯抗病性呈正相關關系[13]；向日葵感染核盤菌后，抗病品種中可溶性蛋白含量降低，但仍顯著高于感病品種，MDA含量與抗病性呈負相關[14]。由此可見，植物遭受逆境脅迫后的生理生化指標變化與植物的抗病性有一定的關系。

據報道，引起核桃褐斑病的病原菌種類復雜多樣，核桃日規殼(Ophiognomonialeptostyla)就是引起褐斑病的病原菌之一，學者對該病原菌與核桃的反應機制、感病后核桃酚類物質含量的變化以及該病原菌的繁殖特性等進行了研究[4,15-16]， 但主要是圍繞黑核桃(Juglansnigra)和英國核桃(Juglansregia)等展開，缺少與泡核桃相關報道。而缺乏泡核桃品種抗病性選擇相關的策略，極大程度限制了泡核桃抗病育種的進程。研究寄主植物受病原菌侵染后的生理生化變化，對揭示植物抗性生理基礎有著重要意義。2020年，本課題組首次從泡核桃病葉中分離、鑒定得到核桃日規殼病原菌，并驗證其是導致泡核桃褐斑病的主要致病菌[17-18]，目前尚缺乏泡核桃抵抗該病原菌侵染的生理生化反應的相關研究。鑒于此，本研究以抗、感褐斑病的泡核桃無性系為實驗材料，考察了褐斑病病原菌侵染對不同抗性無性系葉片中抗氧化酶活性及葉綠素、總酚等含量的影響，探討不同抗病性泡核桃對褐斑病病原菌響應的差異，以期為揭示泡核桃抗褐斑病的生理機理、泡核桃抗病機理研究和抗病品種選育及遺傳改良提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料和菌株

供試植物材料為4年生抗病(199)和感病(64)泡核桃(Juglanssigillata)無性系。供試菌株為本課題組前期從泡核桃褐斑病病斑分離、鑒定的核桃日規殼(Ophiognomonialeptostyla)SICAUCC 20-0012菌株[17-18]。

1.2 實驗設計與生理指標測定

1.2.1 孢子懸浮液的制備在超凈工作臺內，將培養10 d左右的核桃日規殼菌株倒入少量無菌水，用無菌玻璃棒輕輕刮下孢子，再用孔徑為75 mm的無菌尼龍布過濾掉菌絲及其他雜質，使用血球計數板，將孢子懸浮液的濃度調至107個/mL，備用。

1.2.2 接種方法將配置好的分生孢子懸浮液裝入噴壺中，采用針刺噴灑接種法對健康、無缺陷的葉片進行接種(圖1)。接種前葉片用0.6%的次氯酸鈉消毒、滅菌，無菌水沖洗，接種后葉片用塑料袋密封保濕24 h。抗病和感病無性系均接種6株(6個生物學重復)，同時抗病和感病無性系均設置空白對照(6株，接種無菌水)，總共24株。每株東南西北四個方向各接種10枝，每個枝上除了頂端、末端的葉片，其他成熟葉片均接種。分別在接種后1、5、9、16、27和34 d采集核桃葉片。每個時間點，每株上取長勢一致的5片葉片混合為1個樣品。所有的樣品液氮速凍，-80 ℃保存備用，用于后續生理生化指標測定。

A為處理組接種；B為空白對照組接種圖1 接種方法示意圖A represents the inoculation of the resistant/susceptible clone treatment group, B represents the blank control groupFig.1 Graphical explanation of inoculation method

1.2.3 葉片帶菌率調查計算將新鮮葉片用無菌解剖刀切割為1 cm×1 cm的方塊，置于含有1.5 g/L三氯乙酸[V(乙醇)∶V(氯仿)=3∶1]的脫色液中脫色24 h，期間更換脫色液2次至脫色液不再變色，然后將脫色后的葉片轉入飽和水合氯醛(2.5 g/mL)中透明24 h。待組織透明后用水洗凈，經稀苯胺藍的水溶液(0.01 g/mL)染色 5 min，用甘油做浮載劑于顯微鏡OLYMPUS BX51下觀察、記錄[19]。統計不同時期單張葉片的病原菌數量(每個無性系10張葉片)，最后計算葉片單位面積病原菌數量，即單位面積帶菌率(個/cm2)。

1.2.4 生理生化指標測定超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑光還原法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創木酚法；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定采用紫外比色法[20]。過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外吸收法[21]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定采用反式肉桂酸升高速率計算的方法; 多酚氧化酶(PPO)活性測定采用鄰苯二酚比色法[22]。

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法；葉綠素含量測定采用丙酮法[21]。類黃酮含量測定采用甲醇法[23]。總酚含量參照總酚提取試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行提取，并采用紫外分光光度計測定吸光度值，根據公式計算含量。每個生理生化指標重復測定3次，取其平均值。

1.3 數據處理

采用Excel 2010進行數據整理，SPSS 26.0軟件進行統計分析，對不同時期下的數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較檢驗差異顯著性。采用GraphPad Prism 8.0軟件進行可視化作圖。文中所得數據均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 接種后兩個泡核桃無性系葉片帶菌率比較

表1顯示，接種褐斑病病原菌后，泡核桃抗病無性系199葉片帶菌率在各時間段內均顯著低于感病無性系64(P<0.05)。同時，在整個侵染時段內，抗病無性系199葉片帶菌率無明顯變化，帶菌率在3.45～3.93個/cm2之間；而感病無性系64在接種9 d后葉片帶菌率顯著上升，34 d時帶菌率最高(10.27個/cm2)。可見，泡核桃感病無性系葉片表面更有利于病原菌生長和繁殖，葉片帶菌率顯著較高。

表1 接種后兩個泡核桃無性系葉片帶菌率變化情況

2.2 接種病原菌對泡核桃無性系葉片防御酶活性的影響

2.2.1 抗氧化酶活性在接種病原菌后，泡核桃抗、感病無性系葉片的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)及抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性均隨著侵染時間的增加表現出先升高后降低的趨勢，且它們的SOD、POD和APX活性均在16 d時達到最高，抗、感病無性系分別為198.04/237.26、354.45/145.48和0.23/0.17 U/g，而CAT活性則分別在接種后16 d和27 d達到最大值(圖2)。其中，抗病無性系接種和對照處理葉片的SOD活性始終低于相應的感病無性系，并且大多時期存在顯著差異(P<0.05)；與對照相比，感病無性系葉片SOD活性在接種后1 d、5 d時顯著降低，而抗病無性系則在接種9、24 d時顯著增加，34 d時顯著降低，它們在其余時間段均無顯著變化。同時，抗病無性系接種和對照處理葉片POD和APX活性在各時段也均不同程度地高于感病無性系，并且大多時期存在顯著差異(P<0.05)；與對照相比，感病無性系POD活性在接種后1和34 d顯著降低，在9～16 d顯著升高，其APX活性在接種5～16 d均顯著升高，其余時段無顯著變化；抗病無性系POD活性在接種后9 d比對照顯著降低，在16～34 d均顯著升高，其APX活性在接種5～9 d均顯著升高，在接種34 d顯著降低，其余時段無顯著變化。另外，接種病原菌后，感病無性系CAT活性在接種5 d顯著低于相應抗病無性系，在接種9～34 d均顯著高于抗病無性系；與對照相比，感病無性系CAT活性在接種1～5 d時顯著降低，在接種16～34 d顯著升高，而抗病無性系CAT活性在接種5和34 d顯著降低，在接種9和27 d顯著升高。可見，接種褐斑病菌均會使兩個無性系葉片內抗氧化酶活性發生不同方向、不同程度的變化。

2.2.2 PPO和PAL活性圖2顯示，兩個無性系對照組葉片中的PAL活性在整個接種期間沒有發生明顯變化，抗病無性系葉片PAL活性只有在接種5 d時才顯著高于感病無性系(P<0.05)，其余時間無差別；兩無性系各時期接種組與對照組之間也均無顯著差異。抗、感無性系接種后PPO活性均呈現先上升后下降的趨勢，且感病無性系PPO活性達到峰值的時間較早。其中，在接種初期(1～9 d)，感病無性系 PPO活性逐漸增加，并在接種9 d時達到最大值后急速下降，并且感病無性系PPO活性在接種5和9 d時顯著高于對照組，其余時間段無顯著變化；而抗病無性系PPO活性在接種前期(1～16 d)無明顯變化，并于27 d時急劇上升達到最大值(85.8 U·mg-1·min-1)，且顯著高于感病無性系。可見，兩個泡核桃無性系均能通過增強PPO活性對病原菌進行響應，而其PAL活性無顯著變化。

T199、CK199 、T64、CK64分別表示抗病無性系199和感病無性系64接種處理和對照；誤差棒指的是平均值的標準誤；同期不同小寫字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異；下同圖2 抗感無性系接種病原菌核桃葉片后防御酶活性變化T199, CK199, T64 and CK64 stand for the inoculation treatment and control of resistant clone 199 and susceptible clone 64, respectively; Error stick refers to the standard error of average value. The different normal letters in the same time indicate significant difference between treatment group and blank control group at 0.05 level; the same as belowFig.2 Changes of defense enzyme activities in walnut leaves after inoculation of resistant/susceptible clones with pathogens

2.3 接種病原菌對泡核桃無性系葉片丙二醛(MDA)含量的影響

如圖3所示，在接種核桃褐斑病病原菌后，泡核桃抗病無性系葉片MDA含量變化比較平緩，且僅在接種5 d時顯著低于對照，其余時期與對照組均無顯著差異，其在接種34 d時達到峰值。感病無性系葉片 MDA含量在接種后先增加后降低，在接種5 d時達到峰值(5.48 mmol/g)并顯著高于同期對照，而在34 d時顯著低于對照。感病無性系葉片 MDA含量在接種后1～9 d顯著高于抗病無性系，在接種16～27 d無顯著差異，在接種34 d顯著低于抗病無性系。可見，泡核桃抗病無性系199葉片MDA含量在遭受病原菌侵染后不會發生顯著變化，感病無性系葉片MDA含量則會在接種初期顯著增加，并顯著高于抗病無性系，其達到峰值的時間明顯早于抗病無性系。

圖3 抗感無性系接種病原菌后核桃葉片MDA含量的變化Fig.3 Changes of MDA content in resistant/susceptible clones after inoculation in walnut leaves with pathogens

2.4 接種病原菌對泡核桃無性系葉片葉綠素含量的影響

由圖4可知，泡核桃抗、感無性系葉綠素含量在接種褐斑病病原菌后均呈現先增加后降低的趨勢，且抗病無性系在整個侵染時期始終高于感病無性系且大多差異顯著；抗、感病無性系葉綠素含量分別于接種27 d和9 d含量達到峰值，分別為3.84和2.74mg/g，即抗病無性系達到峰值的時間較晚、峰值較高。與對照相比，抗、感無性系葉綠素含量在接種1～16 d均與對照無顯著差異，感病無性系在接種27～34 d顯著低于對照，抗病無性系在接種27 d顯著高于對照，在34 d時顯著低于對照。可見，病原菌侵染后期會顯著降低泡核桃感病無性系葉綠素含量，卻會誘導抗病無性系葉綠素合成，提高葉綠素含量，以利于其抵抗病原菌的入侵。

圖4 抗/感無性系接種病原菌核桃葉片后葉綠素含量的變化Fig.4 Changes in chlorophyll content of resistant/sensitive clones after inoculation in walnut leaves with pathogens

2.5 接種病原菌對泡核桃無性系葉片滲透調節物質含量的影響

如圖5所示，泡核桃抗、感病無性系葉片可溶性蛋白含量在接種病原菌后均呈現先降低后增加的趨勢，且兩個無性系均在接種34 d達到峰值；抗病無性系葉片可溶性蛋白含量在接種27 d時顯著高于同期對照(P<0.05)，其余時間無顯著變化，而感病無性系在接種16 d時顯著低于其對照組，接種27 d時顯著高于其對照組，其余時期無差別；抗、感無性系葉片可溶性蛋白在接種16 d時存在顯著差異，且抗病無性系顯著高于感病無性系(P<0.05)。同時，接種病原菌后，抗病無性系葉片可溶性糖含量在接種1和5 d顯著低于感病無性系，34 d顯著高于感病無性系；與對照組相比，抗病無性系可溶性糖含量在接種5和27 d顯著降低，在34 d顯著升高，而感病無性系可溶性糖含量在接種1 d顯著降低，其余各時期變化并不顯著。可見，病原菌侵染后期均會使泡核桃抗、感病無性系積累少量可溶性蛋白和可溶性糖，增強植物的抗病性，參與抵抗病原菌的侵染過程。

圖5 抗/感無性系接種病原菌后核桃葉片滲透調節物質含量的變化Fig.5 Changes of osmotic adjustment substances in resistant/susceptible clones after inoculation in walnut leaves with pathogens

2.6 接種病原菌對泡核桃無性系葉片酚類等抑菌相關物質含量的影響

圖6顯示，接種后5～34 d，泡核桃抗病無性系葉片的類黃酮含量均顯著低于相應的感病無性系(P<0.05)，且抗、感兩個無性系葉片類黃酮含量均在接種9 d時達到峰值，分別為0.64和0.78 mg/g；與對照組相比，抗病無性系類黃酮含量在接種9 d時顯著升高，在接種16和34 d時顯著降低，而感病無性系在接種27 d時顯著升高，34 d時顯著降低，其余時間段無顯著變化(圖6)。同時，接種后抗病無性系葉片總酚含量始終顯著低于相應的感病無性系(P<0.05)；抗病無性系接種后總酚含量整體變化不大，在接種9 d達到峰值(51.01 mg/g)，而感病無性系的總酚含量呈現上升趨勢，在接種27 d時達到峰值(87.11 mg/g)。與對照組相比，抗病無性系接種16 d時顯著降低，而感病無性系接種27和34 d時顯著升高。可見，病原菌更容易誘導感病無性系64產生較多的總酚和類黃酮，抑制病原菌的繁殖。

圖6 抗/感無性系接種病原菌后酚類抑菌物質含量的變化Fig.6 Changes in the contents of phenolic antibacterial substances after inoculation with pathogens bacteria in resistant/susceptible clones

3 討 論

酶的防御反應作用是植物抵抗病原菌侵染的最基本反應，研究表明超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等防御酶對植物的抗病性有重要作用[24-26]。

植物受到病原物侵染時，會通過苯丙烷類代謝途徑合成木質素、類黃酮、植保素等抗菌物質，參與抵抗生物或微生物脅迫[31]。總酚和類黃酮是苯丙烷代謝途徑產生的能夠抑制病原菌生長和繁殖的物質，其含量的高低與植物的抗病性也有一定關系[12,28,32]。本研究中，接種褐斑病病原菌16 d以后，泡核桃感病無性系64葉片類黃酮和總酚含量高于抗病無性系199，說明感病無性系在受到褐斑病侵染后，可能通過增加葉片中總酚和類黃酮含量對病原菌進行響應，減少自身細胞損傷程度。而PPO可以通過苯丙烷類代謝途徑產生這兩種物質，接種后感病無性系葉片PPO活性也增加，可以將PPO及其相關代謝物質(類黃酮、總酚)的變化看作是植株感病后組織內部發生的“生化癥狀”，這種內部“生化癥狀”和外部病癥是統一的[33]。所以，可以利用感病無性系染病后PPO活性升高、類黃酮和總酚含量變化大，而抗病無性系變化小的特點，作為篩選抗病品種的指標。另外，接種褐斑病病原菌后，泡核桃感病無性系64葉片表面病原菌的數量始終增加并且顯著多于抗病無性系199，表明感病無性系更有利于病原菌生長繁殖和入侵，葉片的防御系統不能有效抵御病原菌入侵，從而加重葉片損害程度，因此就需要產生較多的總酚和類黃酮來抑制病原菌的繁殖，故類黃酮和總酚含量也相對較高。本研究僅對葉片表面的病原菌數量進行了觀察，而抗病和感病無性系葉片內部是否有病原菌的入侵或繁殖尚不清楚，可能侵入葉片內部的病原菌對核桃的抗性影響更大，所以病原菌與核桃互作的機制還有待于進一步研究探討。

植物在逆境脅迫下的細胞膜損傷可以根據受影響組織中丙二醛(MDA)的含量來判斷，MDA在植物抗性方面已有很多研究，與植物抗病性呈負相關關系，含量越高說明細胞損傷越嚴重[11,34-35]。本實驗中，泡核桃抗病無性系接種褐斑病病原菌后MDA含量并無明顯變化，可能是因為其葉片產生的一些生理活性物質或防御酶及早地發揮作用，具有較強的清除ROS的能力，引起生物膜損傷的程度小，增加了其抗性；而感病無性系64在病原菌侵染后葉片MDA含量增加，是由于發揮防御作用的酶活性較低，不能及時清除過量ROS，使細胞膜脂過氧化嚴重。

此外，植物的光合作用離不開葉綠素，而葉綠素含量的高低又與植物抗病性緊密相關，大量研究結果均表明葉綠素含量越高，植物的抗病性就越強[36-37]。本研究發現，接種褐斑病病原菌后，泡核桃抗病無性系葉片葉綠素含量始終高于感病無性系，且達到峰值的時間較晚。說明病原菌侵染后，抗病無性系葉片會積累大量葉綠素，增強自身的光合作用效率，合成較多有機物質提高自身新陳代謝速度，增強植物的抗性；而感病無性系的自我調節能力低于抗病無性系，葉綠素合成途徑受阻，葉片損傷嚴重，表現出明顯的病癥，進一步證明葉綠素含量的變化與植物抗病性有關。另外，可溶性糖和可溶性蛋白質是植物體內重要的滲透調節物質，在植物的抗病性方面發揮著重要作用[27,31,38]。本研究發現，泡核桃接種褐斑病病原菌后可溶性蛋白和可溶性糖含量變化較平緩，且差異并不明顯；在接種后期抗、感病兩個無性系可溶性蛋白和可溶性糖含量逐漸增加，說明病原菌侵染后期才會影響植物的滲透調節系統，增加這兩種調節物質積累，抵抗病原菌的入侵，且這兩種物質含量的高低與泡核桃的抗病性強弱無關。

綜上所述，褐斑病病原菌侵染會影響抗、感泡核桃葉片的生長發育、抗氧化系統和滲透調節系統的功能。接種褐斑病病原菌后，泡核桃感病無性系更容易受到病原菌侵染，其葉片表面病原菌的數量始終增加并且顯著多于抗病無性系。抗病無性系通過增加SOD、POD、APX和PPO的活性以及積累較多葉綠素、可溶性蛋白和可溶性糖進而抵御病原菌的侵染；感病無性系通過提高CAT和PPO活性來增加總酚及類黃酮含量，從而減輕自身過氧化程度，抑制病原菌生長。這些均表明抗、感泡核桃無性系應答核桃日規殼病原菌脅迫的生理生化反應各不相同，在今后的研究中還應從遺傳、分子角度等深入研究泡核桃的抗病機理，進一步從基因水平上解析泡核桃的抗病機制。