血清炎癥因子在糖尿病性心肌病患者中的表達及其對心肌細胞線粒體功能的影響

朱雅倩, 胡高超, 瞿星光

(湖北省枝江市人民醫院/湖北省宜昌市中心人民醫院枝江分院 重癥醫學科, 湖北 宜昌, 443000)

糖尿病性心肌病(DCM)是臨床常見的糖尿病并發癥，患者臨床表現為心肌功能不全，影像學檢查可見左心室膨大，收縮能力下降，但患者無冠狀動脈粥樣硬化、高血壓病等其他心血管疾病。DCM最終進展為心力衰竭，甚至引發心源性休克和猝死，嚴重威脅糖尿病患者的生命健康[1]。DCM的發病機制已有較多研究，通常認為慢性高血糖引發活性氧(ROS)過度積累，進一步通過影響心肌細胞鈣離子穩態和糖脂代謝穩態，導致心肌細胞線粒體功能異常，最終影響心肌功能[2]。研究[3-4]發現，白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子與DCM的發病密切相關。

IL-1β和IL-18是炎癥小體介導釋放的一類炎癥因子，在腫瘤和多種感染性疾病中發揮了重要作用[5]。研究[6-7]發現，二甲雙胍、SIRT3等可以通過調控炎癥小體的活性，影響心肌細胞功能，干預DCM的發病。但IL-1β和IL-18是否與DCM發病存在關聯的研究較少。本研究觀察IL-1β和IL-18在DCM患者外周血中的表達水平，并分析其對心肌細胞線粒體功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019—2021年診斷為DCM的患者104例為研究對象(DCM組)。納入標準: 符合2010年美國糖尿病協會發布的2型糖尿病(T2DM)診斷標準者; 就診前半年內出現心力衰竭、心律失常、胸悶和端坐呼吸等心肌功能異常的癥狀和體征者; 影像學檢查顯示左心室舒張功能減退者。排除標準: 合并冠心病、先天性心臟病、高血壓性心臟病、病毒性心肌炎等其他繼發心肌病者; 合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、肝腎功能不全等疾病患者。另選取90例健康志愿者作為健康對照組。

1.2 試劑和材料

IL-1β和IL-18 Human ProcartaPlexTMSimplex檢測試劑盒、DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)購自美國賽默飛世爾科技公司; 重組人IL-1β、重組人IL-18細胞因子購自美國R&D system公司; CCK-8細胞活性檢測試劑盒、JC-1線粒體活性檢測試劑、線粒體通透性轉換孔(MPTP)檢測試劑盒均購自上海碧云天生物科技公司; 鼠源抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗Clevead-Caspase-3(C-Casp3)抗體和抗GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 血清IL-1β、IL-18檢測: 臨床采集健康志愿者和DCM患者外周血血清樣本，凍存于-80 ℃超低溫冰箱。使用IL-1β和IL-18 Human Procarta PlexTMSimplex細胞因子檢測試劑盒，在LuminexTM200設備平臺檢測各組血清樣本的IL-1β、IL-18表達水平。

1.3.2 細胞培養及分組: 人心肌細胞系AC16購自美國Sigma-Aldrich公司，細胞培養在含10% FBS的DMEM完全培養基中。AC16細胞分為對照組、IL-1β組和IL-18組。對照組僅用完全培養基培養, IL-1β組和IL-18組分別加入終濃度為10 ng/mL的重組人IL-1β或IL-18, 放置于37 ℃的CO2培養箱中培養。

1.3.3 細胞增殖實驗: AC16細胞接種于96孔細胞培養板，每孔1×104個細胞。在分組培養24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑, 37 ℃孵育1 h。隨后利用酶標儀檢測450 nm的吸光值，并計算細胞相對增殖活力。

1.3.4 線粒體膜電位檢測: 胰酶消化各組AC16細胞，重懸后取100 μL細胞懸液，加入100 μL JC-1染色工作液，放置于37 ℃孵育20 min。隨后離心收集細胞沉淀，漂洗2次，最后用500 μL緩沖液重懸細胞，用流式細胞儀檢測細胞紅色和綠色熒光信號，并統計紅色信號減弱的細胞比率。

1.3.5 線粒體通透性轉換孔檢測: 胰酶消化離心各組AC16細胞，重懸并調整細胞密度為1×106/mL。取100 μL細胞懸液，加入鈣黃綠素(Calcein AM)染色液，放置于37 ℃避光孵育30 min。離心收集細胞，加入500 μL檢測緩沖液重懸細胞沉淀，用流式細胞儀分析綠色信號強度，并計算各組細胞平均熒光強度(MFI)。

1.3.6 Western blot實驗: 收集各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液, 4 ℃孵育30 min。隨后離心收集上清全細胞裂解液，加入5×SDS上樣緩沖液, 100 ℃金屬浴加熱10 min。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，并轉印到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上。PVDF經脫脂奶粉封閉后，分別加入抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗C-Casp3抗體和抗GAPDH抗體稀釋液，室溫孵育2 h。隨后用帶辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h，最后加入顯色底物顯示蛋白條帶。用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算Bax/Bcl-2比值和C-Casp3相對表達水平。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 IL-1β及IL-18在DCM患者血清中的表達水平

與健康對照組相比, DCM組患者外周血血清中IL-1β、IL-18水平均呈升高趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清IL-1β和IL-18水平比較 ng/L

2.2 IL-1β和IL-18對心肌細胞增殖活性的影響

與對照組相比，在加藥后24 h, IL-1β和IL-18處理的心肌細胞系AC16細胞增殖活力略下降，但差異無統計學意義(P>0.05); 繼續加藥培養至48、72 h后, IL-1β和IL-18均抑制AC16細胞的增殖活性，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞增殖相對活性

2.3 IL-1β及IL-18對線粒體膜電勢的影響

線粒體膜電位由高降低時, JC-1由聚集體轉換為單體，紅色熒光水平下降。對照組JC-1單體比率為(9.17±1.49)%, IL-1β組為(27.55±4.04)%, IL-18組為(20.11±4.81)%; 與對照組相比, IL-1β組和IL-18組線粒體膜電勢下降的細胞比率增加，差異具有統計學意義(P<0.001), 見圖1。

2.4 IL-1β及IL-18對線粒體膜通透性的影響

用鈣黃綠素標記線粒體通透性，流式細胞儀實驗數據表明，與對照組相比, IL-1β組和IL-18組 AC16細胞鈣黃綠素熒光強度增強，見圖2。對照組鈣黃綠素平均熒光強度為(37.69±4.49), IL-1β組為(89.51±8.85), IL-18組為(65.72±4.03); IL-1β組、IL-18組鈣黃綠素平均熒光強度均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.5 線粒體依賴的細胞凋亡

Western blot實驗結果表明, IL-1β或IL-18處理細胞后, Bax蛋白表達水平下降, Bcl-2、C-Casp3表達水平升高，見圖3。對蛋白表達水平定量分析發現，與對照組相比, IL-1β組和IL-18組細胞Bax/Bcl-2、C-Casp3/GAPDH升高，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.001), 見表3。

表3 各組凋亡相關蛋白相對表達水平

3 討 論

炎癥小體在炎癥反應中被激活，并通過激活Caspase-1對IL-1β-pro和IL-18-pro進行剪切，促進炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放[8]。研究[9-10]發現，炎癥小體的活化與心血管疾病的發病具有顯著相關性，但其下游的IL-1β和IL-18在DCM疾病和心肌損傷中的功能尚未闡明。

本研究通過檢測外周血血清中IL-1β和IL-18的表達，發現了IL-1β和IL-18在DCM患者外周血中顯著升高，提示IL-1β和IL-18可能參與了DCM疾病的發生和進展。研究[11-12]發現，通過抑制炎癥小體及下游IL-1β, 可以保護敗血癥引發的心肌損傷; 在急性心肌梗死中，使用IL-1β的中和抗體可以促進心肌細胞排毒和修復。關于IL-18的研究[13]也證實，在腎上腺素引發的心肌炎癥反應中，炎癥小體的活化增加了IL-18的剪切，促進了心臟炎癥損傷。這些研究都提示高水平的IL-1β和IL-18可以直接引起心肌損傷。本研究通過體外培養人心肌細胞AC16研究發現, IL-1β和IL-18可以抑制AC16細胞的增殖活性。進一步研究發現, IL-1β和IL-18不僅可降低心肌細胞線粒體膜電位，也增強了線粒體通透性。

當前研究對DCM具體的致病因素仍不明確，研究[14-15]認為高血糖引發的過氧化物積累和心肌細胞脂質過氧化，可進一步促進細胞自噬和凋亡。在細胞自噬和凋亡的激活中，線粒體都發揮了重要作用。線粒體不僅為心肌細胞提供ATP, 促進心肌收縮，也是心肌細胞糖脂代謝和活性氧產生的重要場所。線粒體膜電位的下降會影響線粒體氧化還原穩態，減少ATP的合成; 線粒體通透性的增加則促進了細胞色素c的釋放，進一步激活了線粒體依賴的細胞凋亡[16]。本研究也發現, IL-1β和IL-18處理的AC16心肌細胞Bax蛋白表達水平升高，而Bcl-2表達水平下降, Bax/Bcl-2比值顯著升高。Bax上調會促進其形成二聚體，打開線粒體膜通道，降低線粒體膜電位，進而促進細胞色素c的釋放。而生理條件下, Bcl-2可以與Bax相互作用，抑制Bax, 維持線粒體膜電位[17]。對Bax、Bcl-2表達水平的分析結果與既往研究中線粒體膜電位下降、線粒體通透性增加的結果相一致，表明IL-1β和IL-18作用于心肌細胞，可以促進線粒體依賴的細胞凋亡。

本研究也存在不足，體外實驗及細胞系實驗存在一定的局限性，本研究后續將結合藥物誘導的DCM疾病模型小鼠以及小鼠原代心肌細胞，深入探究IL-1β和IL-18在調控DCM疾病進展及心肌細胞損傷中的作用機制。

綜上所述, DCM疾病進展中，炎癥小體相關的炎癥因子IL-1β和IL-18表達水平升高。IL-1β和IL-18則通過抑制線粒體活性，促進線粒體依賴的細胞凋亡影響心肌細胞的活性，誘導心肌損傷。本研究揭示了炎癥小體相關因子促進心肌細胞損

傷的作用，為深入了解DCM的發病機制提供了新視角。