基于網絡藥理學探討熱毒寧注射液治療登革熱的分子機制

吳鵬，江勇，鄭文江，賴艷妮，黃秀芳，莊轟發，詹少鋒，劉小虹

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州510405；2.深圳市中西醫結合醫院，廣東深圳518104；3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州510405）

登革熱（Dengue fever）是感染登革病毒（Dengue virus）引起的一種急性傳染病，廣泛流行于全球熱帶及亞熱帶地區，主要通過蚊媒傳播。據世界衛生組織（WHO）[1-2]統計，登革熱在過去的50年間發病率增加了30倍，全球約有25億人口面臨登革熱感染風險，各成員國報告的病例數高達320萬人。隨著全球變暖，其流行范圍有向溫帶和寒帶擴散的趨勢，日益頻繁的國際交流和經貿合作也為輸入性疫情防控帶來了嚴峻挑戰。

登革病毒可分為4種血清型，各血清型之間、登革病毒與其他黃病毒屬病毒之間具有交叉反應。其發病機制尚不明確，但多認為與抗體依賴的增強感染作用（ADE）、細胞因子風暴、宿主遺傳多態性、病毒分子、先前感染病史等因素有關[3-4]，給抗病毒治療藥物和疫苗的研發帶來了極大的挑戰。由于缺乏有效的抗病毒治療藥物，目前臨床上治療登革熱以對癥支持為主[5]。首個獲批上市的疫苗存在增加罹患重癥登革熱的風險，僅推薦用于流行地區既往感染的人群使用，無法滿足防治需要[2]。因此，開發天然的中草藥可為相關研究提供新的思考方向。

熱毒寧注射液是由青蒿、金銀花、梔子組成的中藥注射液制劑，具有清熱、疏風、解毒作用，臨床上被廣泛應用于感染性急癥的治療。作為國家二類新藥，已被多部國家衛生部發布的診療指南收錄，用于登革熱、甲型H1N1流感、人感染H7N9禽流感、足口病和新型冠狀病毒肺炎等病毒性傳染病的救治[6-7]。證據顯示，熱毒寧注射液治療普通型登革熱，不僅在縮短發熱時間、改善白細胞和血小板水平、提高痊愈率方面具有顯著優勢，而且安全性良好[8]。鑒于中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點及網絡藥理學的系統整合研究方法[9]，本研究試從網絡藥理學角度分析熱毒寧注射液治療登革熱的分子機制，以期為進一步研究提供科學依據，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 藥效成分及作用靶點的收集首先收集公開報道的熱毒寧注射液藥效成分[10-11]，然后將化合物名稱輸入PubChem數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下載其2D結構SDF文件，并將文件逐一上傳至SwissTargetPrediction數據庫（http://www.swisstarget-prediction.ch/），限定物種為人，以CSV文件格式下載數據庫預測的各個藥效成分靶標基因，剔除Probability為0的靶點后，將所有成分-靶點整合至一張Microsoft Excel表格備用。

1.2 登革熱相關靶點收集以“dengue”為檢索詞在CTD（http://ctdbase.org/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）中獲取登革熱相關基因，將所有基因整合至Excel表格，刪重備用。

1.3 關鍵靶點蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡構建將“1.1”和“1.2”項獲得的藥物靶點和疾病靶點分別上傳至Draw Venn Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪 制 韋 恩圖，并獲取交集靶點基因列表。將交集靶點列表上 傳 至STRING數 據 庫（https://string-db.org/，Version 10.5）。限定物種為人，獲取靶蛋白之間的作用關系，并將結果保存為TSV文件格式，將文件導入Cytoscape 3.7.1可視化得到初始PPI網絡。用其工具Network Analyzer對該網絡進行拓撲分析，根據節點度（Degree）值的2倍中位數篩選出關鍵靶點，隱藏其余靶點，并可視化展示。

1.4 藥效成分-交集靶點網絡構建及關鍵藥效成分篩選將“1.1”和“1.3”項獲得的藥效成分靶點與交集靶點相互映射，通過Cytoscape 3.7.1構建藥物活性成分-交集靶點網絡。利用網絡的篩選功能，在交集靶點中展示“1.3”項獲得的關鍵靶點，并反向篩選出關鍵靶點對應的藥效成分，作為關鍵藥效成分。

1.5 基因本體論（GO）富集分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析將交集靶點上傳 至Metascape（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。限定物種為人，選擇“自定義分析（custom analysis）”，分別進行GO富集分析和KEGG通路分析。其中，GO富集分析包括生物過程（biological process）、分 子 功 能（molecular function）和細胞組分（cellular component）3個模塊；KEGG通路分析設定P＜0.01，以確定交集靶點富集通路，進一步去除其他疾病信號通路，篩選出關鍵靶點富集較多的通路作為關鍵通路。

2 結果

2.1 熱毒寧注射液藥效成分本研究通過對文獻的收集整理，得到熱毒寧注射液化學成分72個，最終在PubChem數據庫檢索到32個成分，結果見表1。

表1 熱毒寧注射液藥效成分信息Table 1 Information on pharmacodynamic constituents of Reduning Injection

2.2 藥物靶點和疾病靶點收集經SwissTargetPrediction數據庫預測，32個化合物共獲得1 350個靶點，刪重后得到410個。以“dengue”為檢索詞，分別在CTD得 到2 675個、GeneCards 735個、OMIM 24個、TTD 3個靶點基因，刪重后得到3 219個靶點。

2.3 關鍵靶點PPI網絡構建將上述藥物靶點與疾病靶點上傳至Draw Venn Diagram獲得兩者交集的靶點154個，見圖1-A。將154個交集靶點上傳至STRING平臺，獲得PPI網絡TSV文件，再導入Cytoscape 3.7.1軟件得到初始PPI網絡，經Network Analyzer拓撲分析后將結果導出至Excel 2016，按照度值降序排列154個靶點，計算得到所有節點的度值的2倍中位數為44，由此篩選出度值≥44的關鍵靶點29個。返回Cytoscape中的初始網絡，利用其篩選和隱藏功能，構建出關鍵靶點PPI網絡，見圖1-B。

2.4 藥效成分-交集靶點網絡構建及關鍵藥效成分篩選將熱毒寧注射液的31個成分[苯甲酸（Mol27）無交集靶點，棄去]與154個交集靶點導入Cytoscape進行網絡構建和可視化，并篩選出關鍵靶點對應最多的成分為關鍵成分，見圖1-C。如圖所示，熱毒寧注射液活性成分與交集靶點網絡圖共包含185個節點，503條邊。菱形節點代表熱毒寧注射液活性成分，圓形節點代表交集靶點，黃色節點代表篩選出的關鍵靶點及關鍵藥效成分，節點越大表示該節點的度值越大，在網絡中可能發揮樞紐作用。31個成分中有27個與關鍵靶點相作用，選取與關鍵靶點作用最多的8個成分進行展示，分別為異落葉松脂素（Mol9）、木犀草素（Mol16）、反式咖啡酸（Mol24）、5’-甲氧基異落葉松樹脂醇（Mol7）、落葉脂素（Mol8）、異鼠李素（Mol12）、槲皮素（Mol13）和反式阿魏酸（Mol25），各作用于10、10、8、7、7、7、7、7個關鍵靶點，可能是熱毒寧注射液發揮治療作用的重要物質基礎。

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析GO富集分析得到條目1 501個（P＜0.05），其中生物過程條目1 388個，細胞成分條目30個，分子功能條目83個。選取排名前20位的GO條目繪制柱狀圖，見圖1-D~F。

GO富集分析結果顯示：生物過程分析中富集靶點較多的有轉移酶活性的正調控、對氧化應激的反應、對細菌來源分子的反應、活性氧代謝過程、細胞因子產生的正調控、細胞對氮化合物的反應、對創傷的反應和肽酰絲氨酸修飾等；細胞組分分析中富集靶點較多的有膜筏、胞質囊腔、膜側、局灶性黏附、突觸后、胞質核周區、細胞外基質和線粒體外膜等；分子功能分析中富集靶點較多的有以醇基為受體的磷酸轉移酶活性、激酶結合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質結構域特異性結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、血紅素結合、絲氨酸水解酶活性和熱休克蛋白結合等。

KEGG富集分析得到條目142個（P＜0.01），排名前20位的通路有甲型流感、HIF-1信號通路、EB病毒感染、癌癥中的微小RNA、NF-κB信號通路、小細胞肺癌、軍團菌病、白細胞跨內皮遷移、類固醇激素的生物合成、阿爾茨海默氏病、卵母細胞減數分裂、多巴胺能突觸、癌癥中的轉錄失調、碳水化合物的消化吸收、黏附連接、肌萎縮性側索硬化癥、內質網中的蛋白質加工、抗葉酸抵抗、線粒體自噬-動物、補體和凝血級聯，見圖1-G。將這些通路及其包含的基因導入Cytoscape進行網絡構建和可視化，不考慮其他疾病信號通路，結合文獻檢索及通路中包含的關鍵靶點數量，篩選出前5條關鍵通路，即HIF-1信號通路、NF-κB信號通路、白細胞跨內皮遷移、黏附連接和線粒自噬，分別包含11、5、5、4、4個關鍵靶點，見圖1-H。如圖所示，通路-靶點網絡共包含116個節點，226條邊。圓形節點代表靶點，六邊形節點代表通路，黃色圓形節點代表關鍵靶點，黃色六邊形節點代表關鍵通路。

圖1 熱毒寧注射液治療登革熱的網絡藥理學分子機制Figure 1 Network pharmacologcial molecular mechanism of Reduning Injection in the treatment of dengue fever

3 討論

登革熱作為一種新興病毒性傳染病對人類健康構成了重大的威脅。盡管多數情況下感染登革病毒引起的臨床癥狀較輕，但部分患者可出現嚴重出血、休克或臟器損傷等危重表型，致死率高。迄今尚無有效的策略用于預防和治療登革病毒感染。中醫藥治療登革熱安全有效，因此受到研究人員的廣泛關注。熱毒寧注射液由金銀花、青蒿、梔子3味中藥組成，具有疏風、清熱、解毒的作用，被衛生部推薦用于登革熱的治療。基于中藥多成分、多靶點、多途徑調控疾病的特點，本研究利用系統藥理學及網絡可視化方法探討熱毒寧注射液治療登革熱的作用機制，首先對熱毒寧注射液治療登革熱的154個潛在靶點進行PPI網絡分析，然后依據網絡拓撲分析節點度值篩選出前29個關鍵靶點，再通過關鍵靶點反向篩選出關鍵成分、關鍵通路，以期為其基礎研究和臨床應用提供參考。

本研究篩選的29個關鍵靶點包括GAPDH、AKT1、TNF、MAPK3、CASP3、MAPK1等，涉及能量代謝、細胞凋亡、炎癥反應等生物過程。GAPDH主要參與細胞糖酵解途徑，近年來研究發現GAPDH還能參與許多亞細胞水平活動，包括催化微管聚合、參與蛋白磷酸化修飾、參與膜融合和膜轉運、促進細胞凋亡、調節蛋白質的表達、參與DNA損傷修復、作為轉鐵蛋白受體等[12]。有研究[13-14]發現，登革病毒通過調節GAPDH活性，增加糖酵解通量、影響病毒轉錄過程及宿主細胞脂質穩態，從而促進感染和增殖。AKT1是AKT激酶的主要亞型之一，調節代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等多個生物過程。PI3K/AKT信號通路參與感染早期細胞的存活及促進登革病毒侵入，而且有助于病毒蛋白翻譯[15]。運用該通路的抑制劑，可以抑制登革病毒復制[16]。TNF是細胞凋亡直接相關的促炎細胞因子。在登革熱急性期，重癥患者均可見顯著升高的TNF-α[17-18]。TNF-α在登革熱感染中具有雙重作用。一方面，高表達TNF-α等位基因與登革出血熱/登革休克綜合征（DHF/DSS）的保護之間存在關聯，可能與高水平的TNF-α在感染早期抑制登革病毒負荷相關。但另一方面：①有證據顯示TNF-α并不能抑制病毒復制[19]；②TNF-α可上調樹突狀細胞抗細胞凋亡因子，從而延長感染的樹突狀細胞存活時間，可能對感染重癥化有促進作用[20]；③大量的TNF-α可使血管內皮細胞活化表達免疫黏附因子，直接損傷內皮細胞，誘導血漿滲漏[21]。在重癥登革熱小鼠模型，運用舒尼替尼聯合抗腫瘤壞死因子抗體治療具有抗血管生成和抗炎的雙重協同作用[22]，提示抗TNF可能是潛在的治療方式。MAPK參與調節基因表達、分化、增殖、有絲分裂、凋亡和細胞存活等多個過程[23]。肝臟是登革病毒復制和發病機制密切相關的器官，登革病毒感染誘導的MAPK家族磷酸化與血管內皮功能障礙、肝功能損傷、肝細胞凋亡等有關[24]。p38 MAPK、JNK和ERK1/2抑制劑均可調節細胞凋亡的內在和外在途徑，減輕登革病毒感染誘導的肝損傷[25-27]。Caspase家族是細胞凋亡事件中的核心因子，主要分為凋亡啟動因子、執行因子和炎癥介導因子三大類[28]，凋亡啟動因子被激活以后，通過各自介導Caspase酶級聯反應依次激活凋亡執行因子，最終導致細胞凋亡，其中Caspase-3的活化是細胞凋亡的中心環節[29]。

依據29個關鍵靶點篩選出8個關鍵藥效成分，包括異落葉松脂素、木犀草素、反式咖啡酸、5’-甲氧基異落葉松樹脂醇、落葉脂素、異鼠李素、槲皮素和反式阿魏酸。木犀草素通過減少活性氧和活性氮的生成，調節花生四烯酸的代謝和NF-κB、MAPK、AP-1、JAK、STAT等信號通路多途徑發揮抗炎效應[30]。研究顯示，木犀草素在體外能抑制ADE介導的登革病毒感染，在體內對4種血清型的登革病毒復制均有抑制作用[31]。異鼠李素具有心腦血管-神經保護、抗炎、抗缺氧、抗氧化、腎臟保護、肺臟保護、抗菌、抗病毒、調節免疫等作用。異鼠李素通過抑制NF-κB通路調節炎癥介質、細胞因子和ROS的產生，從而發揮抗炎作用；通過激活PI3K/AKT和Nrf2/ARE信號通路抑制細胞凋亡，發揮抗氧化特性；此外，異鼠李素還具有保護血管內皮細胞的效應，可能與其抗炎、抗氧化和抗線粒體依賴性凋亡的作用有關[32]。槲皮素是已被證實的體外抗登革病毒最有效的化合物之一[33-34]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗病毒、抗原蟲、抗菌和保護心血管等藥理作用[35]。研究人員[36-37]運用分子對接等方法發現，槲皮素可能是抑制病毒E蛋白的新型有效候選物之一，并且其衍生物槲皮素3-（6’’-（E）-p-香豆酰基槐糖苷）-7-鼠李糖苷是一種有效的病毒RNA聚合酶抑制劑。由此可見，熱毒寧注射液的活性成分具有抗病毒、保護血管內皮、抗炎、抗氧化等作用，對于登革熱/重癥登革熱導致的細胞因子風暴、血漿滲漏等病理環節具有潛在的治療價值。

由KEGG富集分析結果可知，熱毒寧注射液具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗炎、調節免疫和神經保護等作用。其中與登革熱最相關的通路有HIF-1信號通路、NF-κB信號通路、白細胞跨內皮遷移、黏附連接和線粒自噬，分別包含11、5、5、4、4個關鍵靶點。

HIF-1是機體在分子水平上應答缺氧應激的關鍵代謝調節因子。HIF誘導的蛋白表達主要幫助缺氧細胞的代謝和生存需要，功能包括血管再生、紅細胞生成、凋亡、細胞分化/生存、糖代謝、pH值調節和鐵代謝等。研究證實，登革病毒誘導的缺氧反應及代謝改變可以增強病毒RNA復制，其機制與HIF-1α/2α和AKT表達增強，厭氧糖酵解的增加有關[38]。NF-κB是參與炎癥介質調節的關鍵轉錄因子。在登革病毒感染過程中，NF-κB的激活導致細胞凋亡和過度炎癥反應[39]，導致登革出血熱[40]，其調節的促炎細胞因子TNF-α的水平升高與重癥登革熱有關[41]。因此，開發相關抑制劑下調登革病毒感染誘導的炎癥反應，有望成為新的治療措施[42]。線粒體自噬對于清除損傷線粒體，維持細胞線粒體網絡功能具有重要意義。近年來，病毒感染與線粒體自噬的研究開始受到關注[43]。病毒介導的線粒體自噬有助于防止細胞凋亡，從而促進病毒感染及傳播；另外，線粒體自噬的抗炎效應也可以幫助病毒逃脫宿主的抗病毒免疫防御。線粒體作為協調先天免疫、自噬和炎癥相關信號網絡的中心樞紐，靶向線粒體的療法為登革熱的治療提供了新視角[44]。白細胞跨內皮遷移是指白細胞跨血管內皮從血液向組織遷移，對于免疫監視和炎癥至關重要。該過程有利于控制早期感染事件[45]。黏附連接對于維持組織結構和細胞極性非常重要，是控制內皮通透性最重要的組成部分之一[46]。在登革病毒感染的人內皮細胞模型中可以觀察到黏附連接成分血管內皮-鈣黏蛋白分解，運用特定的抑制劑可以防止分解，并消除登革病毒誘導的跨內皮滲漏[47]。

另外，類固醇激素的生物合成、內質網中的蛋白質加工、補體和凝血級聯通路雖無關鍵靶點富集或富集較少，但與登革熱的發病密切相關。類固醇激素的生物合成屬于脂質代謝通路。研究發現，皮質醇在登革病毒感染早期顯著升高，通過抑制細胞因子和其他促炎介質的產生下調炎癥和免疫反應，有利于病程自限[48]。補體級聯反應的激活可觸發多種抗病毒、免疫調節作用[49]，而且補體替代途徑過度活化與重癥登革熱有關[50]。登革熱進展伴隨的凝血和纖溶紊亂可能導致疾病晚期的彌散性血管內凝血[51]。研究表明，補體和凝血級聯存在多處交匯，共同參與調節免疫和心血管系統功能[52]。鑒于二者級聯的放大效應與疾病進展密切相關，該通路有待進一步研究，為重癥登革熱的診療提供新線索。機體缺血、缺氧、缺乏營養、氧化應激、病毒感染時，內質網內未成熟蛋白和錯誤折疊的蛋白大量滯留，引起內質網應激（ERS）[53]。登革病毒誘導的ERS為體內外自噬激活、病毒復制所必需[54]，并且在病毒生命周期中，登革病毒的復制和翻譯很大程度上局限于ER。因此，調控登革病毒-內質網相互作用的分子可能是有效的干預策略[55]。

綜上所述，熱毒寧注射液治療登革熱可能通過異落葉松脂素、木犀草素、反式咖啡酸、5’-甲氧基異落葉松樹脂醇、落葉脂素、異鼠李素、槲皮素和反式阿魏酸等關鍵成分作用于GAPDH、AKT1、TNF、MAPK、CASP3等關鍵靶點，調節HIF-1信號通路、NF-κB信號通路、白細胞跨內皮遷移、黏附連接和線粒自噬等關鍵信號通路，發揮抗病毒、抗炎、調節免疫、調節凝血和纖溶、調節能量代謝、調節脂質代謝等作用。鑒于網絡藥理學的局限性，本研究結果有待于進一步實驗驗證。