益氣活血法通過抑制細胞焦亡減輕缺血性腦中風急性期大鼠腦組織炎癥

江利敏，劉向哲，桑鋒，郭向東，嵇朋

[1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院體檢中心，河南鄭州450003；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)，河南鄭州450003；3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院重點實驗室，河南鄭州450003；4.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南鄭州450003；5.鄭州市第三人民醫(yī)院（河南大學腫瘤醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科三病區(qū)，河南鄭州450003]

缺血性腦中風（腦卒中）是指腦組織局部供血障礙引起的缺血性壞死，可導致神經(jīng)元損傷、神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)，50%以上患者存在后遺癥，對公共健康的危害性極高，目前在世界人口死亡原因中居第2位[1]。缺血性腦中風在《內(nèi)經(jīng)》中早有相關記載。《素問·經(jīng)脈篇》中的“氣絕則脈不通，脈不通則血不流”是對其氣虛血瘀病機的早期認知。清代醫(yī)者王清任專門以氣虛血瘀立說，創(chuàng)制的補陽還五湯開創(chuàng)了中醫(yī)用益氣活血法治療腦中風的先河。近代醫(yī)者張錫純進一步肯定了益氣活血法在缺血性腦卒中急性期治療中的價值[2]。中醫(yī)現(xiàn)代研究也表明，缺血性腦卒中急性期的中醫(yī)證候主要表現(xiàn)為氣虛血瘀，常選擇益氣活血法[3-5]。

細胞焦亡是一種促炎性程序性細胞死亡方式，是機體重要的免疫防御反應，可破壞病原菌生長環(huán)境，在清除內(nèi)源危險信號中發(fā)揮了重要的作用，但過度細胞焦亡可導致病理性炎癥，誘發(fā)自身炎癥。已有研究[6]表明，細胞焦亡參與了動脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的發(fā)生與發(fā)展，而缺血性腦卒中損傷與腦組織炎癥密切相關，因此，適度抗炎治療有助于該病治療。故本研究開展此次動物實驗，旨在基于細胞焦亡探討益氣活血法對缺血性腦中風急性期大鼠腦組織炎癥的治療作用，以期為中醫(yī)證治缺血性腦中風的研究提供新的依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物47只SPF級7周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量260~270 g，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0010。實驗開展前大鼠適應性飼養(yǎng)1周，自由攝食飲水，保持室溫為（22±3）℃，相對濕度40%~60%，空氣新鮮，自然光照，定期消毒籠具。

1.2 藥物益氣活血方由生黃芪30 g、益母草15 g、當歸15 g、川芎9 g、全蝎9 g、石菖蒲9 g與冰片0.05 g（沖服）組成，中藥材均購自河南康健醫(yī)藥藥材股份有限公司，由河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥制劑室制備成湯劑。

1.3主要試劑與儀器2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（南京森貝伽生物科技有限公司）；蘇木素染液、伊紅染液（成都里來生物科技有限公司）；白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素18（IL-18）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海卡邁舒生物科技有限公司）；兔抗大鼠嘌呤能受體P2X7（P2RX7）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、Caspase-11、消皮素D（GSDMD）等一抗（上海瑞齊生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。A3型大腦中動脈閉塞（MCAO）栓線（北京西濃科技有限公司）；BP211DAG電子天平（德國Sartorius公司）；MK3全功能酶標儀（美國Thermo Fisher儀器有限公司）；BA400Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）

1.4 分組、造模與干預47只SD大鼠留取9只作為假手術(shù)組，其余大鼠用線栓法建造缺血性腦中風急性期模型[7]。方法：用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，在頸正中縱向取2 cm長切口，暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈與頸內(nèi)動脈，切斷頸外動脈及其分支，阻斷側(cè)支循環(huán)血流。從頸外動脈殘端經(jīng)頸內(nèi)動脈導入尼龍線，長度以頸內(nèi)動脈、頸外動脈分叉處起18 mm至大腦前動脈起始處，造成大腦中動脈急性腦缺血，縫合頸部切口，切口外留1 cm絲線殘端。參考Zea-Longa[8]的5級評分法評分：無神經(jīng)損傷癥狀，計0分；無法完全伸展對側(cè)前爪，計1分；向外側(cè)轉(zhuǎn)圈呈追尾狀，計2分；爬行時向?qū)?cè)傾倒，計3分；無法自發(fā)行走、喪失意識，計4分。1~3分表示造模成功。剔除死亡、造模后評分不達標的動物，共計30只造模成功。將30只模型大鼠隨機分為模型組和中藥低、高劑量組，每組10只。假手術(shù)組手術(shù)過程同造模大鼠，但不插入線栓阻斷大腦中動脈。大鼠腦缺血24 h后灌胃給藥：中藥低、高劑量組分別對應給予益氣活血方水煎液4.4、8.8 g（生藥）/kg灌胃，模型組、假手術(shù)組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)給藥15 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 大鼠神經(jīng)功能缺損程度評定造模后給藥第3、7、15天，檢查大鼠運動（異常動作、肌肉狀態(tài)），感覺（觸覺、視覺、本體感覺），反射情況，通過感覺、運動、平衡木實驗以及不正常運動、反射喪失表現(xiàn)，進行神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）[9]。

1.5.2 TTC染色法觀察大鼠腦梗死情況給藥15 d后，處死大鼠，取出大腦（部分腦組織用體積分數(shù)10%中性甲醛固定，留待下一步病理學檢測）部分腦組織于-22℃冷凍0.5 h，從前到后切片（厚度為2 mm），置入TTC溶液中，37℃孵育1 h。TTC被線粒體過氧化氫酶還原，可見組織片皮質(zhì)梗死區(qū)呈白色，正常腦組織呈紅色，部分為白色到紅色過渡區(qū)。顯色完全后置入體積分數(shù)50%甲醛溶液中固定24 h。分離紅色、白色組織后分別稱質(zhì)量。計算腦梗死率：腦梗死率（%）=梗死組織濕質(zhì)量/全腦濕質(zhì)量。

1.5.3 ELISA法檢測大鼠腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α、IL-18含量取冷凍腦組織250 mg，制備勻漿，離心取上清，按照IL-1β、TNF-α、IL-18 ELISA試劑盒說明書進行檢測：①在酶標包被板上設置空白對照孔、標準品孔、待測樣品孔，在標準品孔內(nèi)加入50 μL標準品，待測樣品孔先后加入40 μL樣品稀釋液、10 μL待測樣品，輕輕搖晃混勻；②封板后置入37℃溫箱中溫育1 h；③取出酶標板洗滌；④每孔加50 μL酶標試劑，后面操作步驟同①；⑤加入顯色劑，搖勻后置入37℃溫箱中避光顯色15 min，取出酶標板加50 μL終止液；⑥應用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔光密度（OD）值，計算腦組織IL-1β、TNF-α、IL-18濃度（pg/mL）值。

1.5.4 HE染色法觀察大鼠腦組織病理學表現(xiàn)取體積分數(shù)10%中性甲醛溶液固定的腦組織，脫水、透明、石蠟包埋，制作4 μm厚的切片。切片脫蠟復水，蘇木素染色20 min，鹽酸酒精分化10 s，50℃溫水返藍，置入85%酒精5 min，伊紅染色5 min，水洗5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察腦組織病理學變化情況。

1.5.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠腦缺血半暗帶組織P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD表達取冷凍腦組織100 mg，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液，冰上裂解10 min，離心取上清，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。加上樣緩沖液，沸水浴變性，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離目的蛋白，轉(zhuǎn)印聚偏氟乙烯（PVDF）膜，50 g/L脫脂奶粉封閉1.5 h。取PVDF膜分別置入P2RX7（1∶100）、Caspase-1（1∶1 000）、Caspase-11（1∶1 000）、GSDMD（1∶500）、β-actin（1∶5 000）一抗稀釋液中，搖床上輕搖，4℃孵育過夜。洗膜，將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）稀釋液中，搖床輕搖，室溫孵育3 h后洗膜。將PVDF膜平鋪到保鮮膜上，滴加電化學發(fā)光液（ECL）顯色，放入化學發(fā)光凝膠成像儀暗室內(nèi)曝光。分析目的蛋白相對表達量，目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分OD值/β-actin積分OD值。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死率、炎癥因子水平及蛋白相對表達量等計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分變化比較見圖1。模型組，中藥低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分呈時間依賴性：模型組逐漸升高，中藥低、高劑量組逐漸降低，假手術(shù)組無變化。在造模給藥第3、7、15天，與假手術(shù)組比較，模型組，中藥低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較低（P＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評分變化比較Figure 1 Comparison of changes in neurological function scores of rats in various groups

2.2 各組大鼠腦梗死情況比較與假手術(shù)組比較，模型組，中藥低、高劑量組大鼠腦梗死率較高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、高劑量組大鼠腦梗死率較低（P＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組大鼠腦梗死率較低（P＜0.05）。具體結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠腦梗死情況比較Figure 2 Comparison of cerebral infarction in rats of various groups

2.3 各組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、IL-18水平比較與假手術(shù)組比較，模型組，中藥低、高劑量組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-18水平較高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、高劑量組IL-1β、TNF-α、IL-18水平較低（P＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組大鼠IL-1β、TNF-α、IL-18水平較低（P＜0.05）。具體結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、IL-18水平比較Figure 3 Comparison of levels of IL-1β，TNF-α and IL-18 in rat brain tissue of various groups

2.4 各組大鼠腦組織病理學表現(xiàn)比較假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)完整、清晰，腦膜未見炎癥滲出、水腫、充血，細胞層排列整齊，神經(jīng)元形態(tài)正常；模型組大鼠腦組織大面積炎癥滲出，水腫明顯，細胞崩解，神經(jīng)元空泡變性或呈點狀壞死；中藥低、高劑量組腦組織炎癥滲出、水腫較模型組明顯減輕，細胞形態(tài)、神經(jīng)元空泡變性較模型組改善。具體結(jié)果見圖4。

圖4 各組大鼠腦組織病理學表現(xiàn)比較（HE染色，×400）Figure 4 Comparison of brain histopathological features of rats in various groups（by HE staining，×400）

2.5 各組大鼠腦缺血半暗帶組織P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD蛋白表達水平比較與假手術(shù)組比較，模型組，中藥低、高劑量組大鼠腦缺血半暗帶組織P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD蛋白相對表達量較高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、高劑量組P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD蛋白相對表達量較低（P＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD蛋白相對表達量較低（P＜0.05）。具體結(jié)果見圖5。

圖5 各組大鼠腦缺血半暗帶組織P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD蛋白表達比較Figure 5 Comparison of protein expression of P2RX7，Caspase-1，Caspase-11 and GSDMD of rat cerebral ischemia penumbra tissue in various groups

3 討論

缺血性腦中風歸屬于中醫(yī)學“中風”的范疇，主要病機為氣虛血瘀，其中氣虛為發(fā)病根源，血瘀為病邪核心[10]。因血脈瘀阻、氣血不暢，血外滲為水，水停聚為痰，痰瘀水搏結(jié)于腦內(nèi)，最終壅滯腦竅。益氣，氣行可化脈中瘀阻，氣旺可助新血生化，可“治本”；活血，血活則瘀祛脈通，新血得生，可“治標”。益氣、活血同治，則活血而不傷正，故中醫(yī)學以益氣活血法為缺血性腦中風急性期的主要治則。本研究中的益氣活血方源自臨床，由當歸、黃芪、川芎、全蝎、益母草、石菖蒲、冰片構(gòu)成。黃芪為“補氣圣藥”，可助血脈運行，氣足則血生，為君藥；當歸、川芎、益母草可化瘀活血，共為臣藥；全蝎可助川芎、當歸通絡活血，冰片、石菖蒲開痰滌竅，為佐使。全方共奏益氣活血、通絡滌痰之功，已在臨床上取得可喜成果[11]。現(xiàn)階段，神經(jīng)保護劑相關研究日益深入，但中醫(yī)藥作為神經(jīng)保護劑治療腦中風的研究較少，故本研究通過動物實驗，分析益氣活血方在保護缺血性腦中風急性期大鼠神經(jīng)功能以及消除腦組織炎癥方面的作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中藥低、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分較低，且隨著給藥時間延長而下降，腦梗死率也較低，提示益氣活血方用于治療缺血性腦卒中急性期，可改善神經(jīng)功能缺損、減輕腦梗死。韋克克等[12]亦報道益氣活血法可多途徑、多靶點、多組分、多環(huán)節(jié)地保護腦缺血再灌注后神經(jīng)元，從而縮小腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能損傷。

有研究[13-14]報道，炎癥加重了缺血性腦卒中模型的腦損傷。炎癥反應是一個復雜過程，大腦發(fā)生缺血性卒中后，中性粒細胞聚集、遷移至大腦缺血區(qū)域，可造成腦組織損傷，且缺血時被激活的細胞釋放出IL-1β、TNF-α、IL-18等細胞因子，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應，從而進一步加重腦缺血損傷，因此，抗炎是缺血性腦中風急性期治療的關鍵環(huán)節(jié)。經(jīng)現(xiàn)代藥理學研究[15]發(fā)現(xiàn)，黃芪、當歸、川芎、石菖蒲等均有抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，中藥低、高劑量組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、IL-18水平均低于模型組；HE染色觀察大鼠腦皮質(zhì)病理學結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織大面積炎癥滲出，水腫明顯，細胞崩解，神經(jīng)元空泡變性或呈點狀壞死，而中藥低、高劑量組的腦組織炎癥滲出、水腫、細胞形態(tài)與神經(jīng)元壞死等情況均改善，提示益氣活血方可降低缺血性腦中風急性期大鼠腦組織炎癥相關因子表達，減輕缺血皮質(zhì)區(qū)域炎癥反應與病理損傷程度，保護神經(jīng)元。

細胞焦亡為促炎性程序性細胞死亡，具有細胞腫脹、崩解、炎癥因子滲出等特征，其過程包括Caspase-1依賴的經(jīng)典途徑、Caspase-11介導的非經(jīng)典途徑。Caspase-1活化后可介導IL-1β、IL-18前體崩解，將其轉(zhuǎn)化為成熟的炎性細胞因子，最終形成“瀑布效應”，導致劇烈炎癥反應發(fā)生。有研究表明，IL-18在Caspase-1表達上調(diào)時被激活，吸引白細胞向病灶聚集，因此，細胞焦亡過程即炎癥反應過程，細胞焦亡程度可在一定情況下反映炎癥進展，二者互相促進[16]。Caspase-11是Caspase-1亞家族成員，可能不直接激活Caspase-1底物IL-18、IL-1β，但可增強Caspase-1活化，與Caspase-1前體一起表達時，釋放的IL-1β含量明顯增多。GSDMD為促炎性Caspase主要基質(zhì)與細胞焦亡執(zhí)行蛋白，在腦中風病理生理學中對程序性細胞壞死具有重要作用。在細胞焦亡機制中，炎癥反應可激活P2RX7受體蛋白表達，導致大量鉀離子外流，使NOD樣受體蛋白3、凋亡相關斑點樣蛋白組成炎性體，募集Caspase-1，促進IL-1β等炎癥細胞因子成熟、釋放[17]。本研究結(jié)果顯示，中藥低、高劑量組P2RX7、Caspase-1、Caspase-11、GSDMD相對表達量低于模型組，提示益氣活血方可能通過抑制細胞焦亡改善缺血性腦中風急性期大鼠腦組織炎癥損傷。

綜上所述，益氣活血法可通過抑制細胞焦亡，減輕缺血性腦中風急性期大鼠腦組織炎癥，達到腦保護的目的。