基于內膜-肌層交界區細胞探討少腹逐瘀湯對子宮腺肌病的鎮痛作用

吳思寧，譚雅文，葉潤英

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州510006；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東廣州510120）

子宮腺肌?。╝denomyosis）是一種良性子宮疾病，病理表現為在距離子宮內膜和肌層之間的交界區2 mm以上的肌層內出現子宮內膜腺體[1]，臨床癥狀主要表現為子宮增大、痛經、異常子宮出血以及不孕不育。近年來，該病的發病率不斷上升，且有年輕化的趨勢，已逐漸成為婦科領域的研究熱點。本課題組前期大量臨床研究發現，中醫藥治療在改善子宮腺肌病臨床癥狀、調經助孕、控制病灶發展及降低復發率等方面具有顯著優勢，通過不斷總結前輩經驗[2-3]，采用少腹逐瘀湯治療子宮腺肌病引起的女性下腹痛獲得了較好的臨床療效。本研究采用體外分離培養人子宮內膜-肌層交界區（EMI）平滑肌細胞，應用少腹逐瘀湯水提液進行干預，進一步探討少腹逐瘀湯治療子宮腺肌病的作用機制，以期為其臨床應用治療子宮腺肌病提供實驗基礎，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本選取收集2019年至2021年在廣東省中醫院婦科住院且擬行全宮切除的30~50歲非絕經期子宮腺肌病疼痛患者3例，疼痛視覺模擬量表（VAS）評分均大于7分，近半年未行激素類藥物治療。手術室無菌操作獲取標本，切開子宮并刮除宮內膜，取內膜下厚約0.5 cm平滑肌層組織1塊，約2 cm×2 cm，置于磷酸鹽緩沖液（PBS）冰浴，0.5 h內送至實驗室進行細胞原代培養。

1.2 藥物及制備少腹逐瘀湯組成配比為當歸∶川芎∶赤芍∶肉桂∶小茴香∶五靈脂∶沒藥∶蒲黃∶延胡索∶干姜=3∶1∶2∶1∶0.5∶2∶1∶3∶1∶1。以上中藥材均購自康美藥業。取同一批次藥材并精準稱量，煎煮2次：第1次加10倍量去離子水煎藥2 h，第2次再加入8倍量去離子水煎藥2 h。混合2次水提液，配制成100 mg/mL的母液，用0.22 μm濾過器過濾2次，分裝成3 mL小樣，-20℃保存。

1.3 主要試劑與儀器高糖DMEM培養基、胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司）；細胞鑒定試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，其中包括細胞角蛋白（CK）抗體和波形蛋白（Vimentin）抗體；人平滑肌肌動蛋白抗體購自美國Abcam公司；血管內皮生長因子（VEGF）兔抗、白細胞介素6（IL-6）兔抗、神經生長因子（NGF）兔抗（北京Bioss公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）小鼠單抗（上?？党晒荆?；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗小鼠免疫球蛋白（IgG）抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體、3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德公司）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d UTP缺口末端標記（TUNEL）法試劑盒（瑞士Roche公司）；雌二醇（E2）、前列腺素E2（PG-E2）、雌激素受體（ER）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析試劑盒（上海博彩公司）；Marker（美國Thermo Scientific Pierce公司）。DV300-1型顯微鏡、TS2光學顯微鏡（日本尼康公司）；170-200P CO2培養箱（英國RS Biotech公司）；JSY-SC-021H全自動細胞計數器（深圳博大博聚公司）；Multiskan MK3型酶標儀（美國賽默飛世爾公司）。

1.4 EMI細胞原代培養、鑒定以及生長曲線繪制無菌操作下將獲取的標本剪碎，消化、終止反應后離心取沉淀細胞，用含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養基制成5×105個/mL的細胞懸液，分裝于T-25培養瓶中。置于CO2培養箱培養24 h，換液，再次置于培養箱繼續培養，2~3 d換液1次。待細胞融合率達到80%~90%，吸出培養液并用PBS洗凈，用2.5 g/L胰蛋白酶消化、離心、取細胞沉淀。細胞沉淀分2批：一批凍存留種；另一批重新用T-25瓶培養，2~3 d換液1次，按照1∶3~1∶4比例傳代。培養至達到實驗要求，即可進行鋪板和加藥操作。其中，第1代細胞行細胞鑒定和生長曲線觀察，第2~5代細胞用于實驗操作。

取第1代細胞于24孔板爬片。細胞成功爬片后，PBS漂洗，用95%乙醇固定；PBS漂洗，0.5%TritonX-100室溫處理；PBS漂洗，滴加一抗α-平滑肌蛋白（α-SMA）、CK（均稀釋100倍），波形蛋白Vimentin（稀釋200倍），空白對照組加PBS，4℃孵育過夜；PBS漂洗后再用3% H2O2室溫封閉；PBS漂洗，滴加DAKO REALTMEnVisionTM/HRP（兔/小鼠）抗體，室溫（25~27℃）孵育30 min；PBS洗3次，DAB底物工作液顯色，鏡下掌握顯色程度；蒸餾水洗，蘇木素輕度復染、飽和磷酸氫二鈉分化；脫水、透明、封片、鏡檢，進行細胞鑒定。

取第1代和第3代細胞，用24孔板進行細胞鋪板，于培養箱培養，每3 d換液1次。每天分別從第1代和第3代細胞鋪板中分別抽取3個孔，應用細胞計數儀進行細胞計數，共10 d。繪制細胞生長曲線。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 MTT法測定少腹逐瘀湯對EMI細胞的增殖抑制率待細胞培養達到實驗的要求制備成懸液，以7 000個/孔、100 μL/孔的密度接種于96孔板，分4組（對照組，中藥低、中、高濃度組），培養24 h后加入不含血清的高糖DMEM（基礎培養液），置于培養箱中饑餓處理24 h；中藥低、中、高濃度組分別加入10、20、40 g/L少腹逐瘀湯水提液（母液用無血清的DMEM配制），對照組加入基礎培養液，繼續培養24 h；輕緩吸走培養液，加入100 μL的MTT培養液（90 μL基礎培養基+10 μL MTT母液5 mg/mL），放入培養箱中孵育4 h；再吸去培養基，加入150 μL DMSO，震蕩10 min至結晶完全溶解，酶標儀測量各孔570 nm波長處吸光度（OD）值，并計算細胞增殖抑制率（%）。細胞增殖抑制率（%）=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。確定少腹逐瘀湯抑制EMI細胞增殖的最佳濃度，作為實驗組，用于后續研究。

1.5.2 TUNEL法測定EMI細胞凋亡率取6孔板細胞爬片達70%~80%時，進行干預誘導（實驗組加入含20 g/L濃度少腹逐瘀湯中藥的基礎培養液；對照組僅加入基礎培養液）24 h后，用40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，PBS漂洗3次，制作細胞樣本。用3%H2O2-甲醇溶液室溫封閉，蒸餾水洗3次；滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，室溫靜置20 min；用含0.1%TritonX-100的檸檬酸鈉溶液冰上孵育爬片2 min；加TUNEL反應混合液（每45 μL標志液，加5 μL酶液）37℃染色1 h，PBS室溫浸洗3次；加Converter-POD反應液室溫孵育30 min后充分浸洗；鏡下控制DAB顯色程度；用去離子水沖洗終止反應，復染，脫水，封片，光學顯微鏡拍照并計數。

1.5.3 ELISA法檢測E2、PG-E2和ER水平藥物處理細胞24 h后，按照上述指標ELISA試劑盒說明書進行操作，分別測定OD值。其中，E2指標采用細胞上清液，PG-E2和ER指標采用細胞沉淀進行檢測。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測EMI細胞VEGF、IL-6、NGF蛋白表達各組細胞處理后，棄培養液，用冷PBS清洗3遍后，采用放射免疫沉淀分析（RIPA）冰上裂解30 min，4℃離心收集上清液，BCA法測定蛋白濃度；在配膠、灌膠后，上樣、電泳、轉膜，用TBST液洗膜2次，5%BSA封閉，搖床震動，4℃過夜；封閉后加入一抗（兔單克隆抗IL-6抗體以1∶1 000稀釋，兔單克隆抗VEGF抗體以1∶1 000稀釋，兔單克隆抗NGF抗體以1∶800稀釋，小鼠單克隆抗GAPDH抗體以1∶1 000稀釋），4℃靜置過夜；洗滌后加入二抗（HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗小鼠IgG，1∶10 000稀釋）孵育1 h；洗膜，加入電化學發光（ECL）液顯色、曝光、定影、拍照。采用SensiAnsys軟件進行圖像數據分析，測定目的條帶灰度值。

1.6 統計方法采用SPSS 22.0統計軟件分析數據。實驗數據以均數±標準差（±s）表示。檢驗正態性及組間方差齊性：若滿足正態性與方差齊性，比較同一樣本多組間數據采用單因素方差分析，比較2組數據采用t檢驗；若不滿足，則采用非參數秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人EMI病灶原代細胞培養與鑒定收集并成功培育人EMI病灶原代細胞，經免疫細胞化學法鑒定，結果見圖1，可見CK、β-SMA、Vimentin蛋白呈陽性表達（示棕褐色染色）。肌成纖維細胞在子宮腺肌病的發展中起重要作用，主要表達CK和α-SMA；Vimentin蛋白主要存在于中胚層起源的細胞中，是間質細胞中重要的中間纖維。因此，圖1中3種蛋白的陽性表達可證實體外培養的原代細胞為子宮腺肌病細胞。

圖1 體外人內膜-肌層交界區（EMI）病灶原代細胞培養與鑒定結果Figure 1 Culture and identification results of primary cells in human EMI lesions in vitro

2.2 EMI細胞的生長曲線圖2結果表明，第1代和第3代的細胞生長曲線基本相同，且第3代子EMI細胞的倍增速度比第1代快。兩者經過1 d滯留期后開始繁殖，第2~7天均為生長期，其中第5~7天呈對數生長，第8天開始進入平臺期，第9天達至相同細胞數。根據既往文獻研究[4]及本研究實驗觀察，EMI細胞可原代培養并傳代，10代內活力穩定，選擇3~6代細胞作為實驗模型最佳。細胞接種后4 h開始貼壁，培養24 h后可完全貼壁。

圖2 體外人內膜-肌層交界區（EMI）細胞的生長曲線Figure 2 Growth curve of EMI cells

2.3 不同濃度少腹逐瘀湯對EMI細胞增殖的抑制情況與對照組比較，中藥高、中、低濃度組EMI細胞增殖抑制率降低（P＜0.05），其中，高、中濃度組效果更顯著（P＜0.05）；中濃度組與高濃度組的抑制作用比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。具體結果見表1。

表1 各組體外人內膜-肌層交界區（EMI）細胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of the inhibition rate in human EMI cell proliferation in vitro among various groups（±s）

表1 各組體外人內膜-肌層交界區（EMI）細胞增殖抑制率比較Table 1 Comparison of the inhibition rate in human EMI cell proliferation in vitro among various groups（±s）

秩和檢驗：①P＜0.05，與對照組比較；單因素檢驗：②P＜0.05，與中藥低濃度組比較

組別中藥低濃度組中藥中濃度組中藥高濃度組對照組吸光度（OD）值0.247 5±0.056 7①0.217 8±0.044 8①0.220 2±0.052 5①0.771 2±0.048 6細胞抑制率/%66.78±1.40 72.11±2.15②71.79±2.51②-

2.4 少腹逐瘀湯對EMI細胞凋亡的影響對照組的EMI細胞核完整，細胞核未被明顯褐染；少腹逐瘀湯中藥干預的實驗組EMI出現較多棕黃色染色的凋亡細胞，貼壁細胞數量減少，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。具體結果見表2、圖3。

表2 2組體外人內膜-肌層交界區（EMI）細胞凋亡率比較Table 2 Comparison of the apoptosis rate of human EMI cells in vitro between the two groups（±s，n=3）

表2 2組體外人內膜-肌層交界區（EMI）細胞凋亡率比較Table 2 Comparison of the apoptosis rate of human EMI cells in vitro between the two groups（±s，n=3）

單樣本t檢驗：①P＜0.01，與對照組比較

組別實驗組對照組細胞凋亡率/%13.58±0.91①5.13±0.58

圖3 2組體外人凋亡內膜-肌層交界區（EMI）細胞分布比較（TUNEL染色，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of apoptotic humar EMI cells in vitro between the two groups（by TUNEL staining，×200）

2.5少腹逐瘀湯對EMI細胞中E2、PG-E2和ER表達的影響少腹逐瘀湯實驗組的E2、PG-E2、ER含量均低于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表3。

表3 2組體外人內膜-肌層交界區（EMI）細胞中E2、PG-E2、ER含量比較Table 3 Comparison of contents of E2，PG-E2 and ER in human EMI cells in vitro of the two groups（±s，pg·mL-1；n=3）

表3 2組體外人內膜-肌層交界區（EMI）細胞中E2、PG-E2、ER含量比較Table 3 Comparison of contents of E2，PG-E2 and ER in human EMI cells in vitro of the two groups（±s，pg·mL-1；n=3）

單因素檢驗：①P＜0.05，②P＜0.01，與對照組比較

組別實驗組對照組E2 73.59±1.22②249.38±58.63 PG-E2 2.40±1.09②16.04±3.39 ER 6.29±2.06①11.01±1.39

2.6 少腹逐瘀湯對EMI細胞中IL-6、VEGF、NGF蛋白表達的影響圖4結果顯示，與對照組比較，實驗組中少腹逐瘀湯處理后的EMI細胞中IL-6、VEGF蛋白表達均下降（P＜0.01），而神經生長因子NGF雖亦表達減弱，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 2組體外人內膜-肌層交界區（EMI）細胞IL-6、VEGF、NGF蛋白表達比較Figure 4 Comparison of protein expression of IL-6，VEGF and NGF in human EMI cells in vitro between the two groups

3 討論

子宮腺肌病根據其臨床癥狀可歸屬于中醫學“痛經”“癥瘕”等范疇，多是由于瘀血蓄積于胞宮、阻滯氣血沖任所致。臨床上，少腹逐瘀湯治療子宮腺肌病引起的女性下腹痛療效較佳[2-3]，其在對癥止痛之余還能從根本上弱化腺肌病，改善月經和生育。少腹逐瘀湯出自清代《醫林改錯》，由10味中藥組成，方中當歸、赤芍、川芎為君藥，具有行氣活血、養血調經之功效；五靈脂、蒲黃、延胡索、沒藥為臣藥，具通利血脈、祛瘀止痛之功；小茴香、干姜、肉桂為佐藥，溫經散寒病引諸藥直達少腹。全方共奏活血化瘀、溫里散寒、散結止痛之效。現代研究也表明其有改善血液黏度、鎮痛、消炎等作用[5-6]。本研究通過觀察少腹逐瘀湯干預后EMI細胞的E2、PG-E2、ER、IL-6、VEGF、NGF水平的變化以及凋亡程度，初步探討該藥治療子宮腺肌病的作用機制。

本研究采用體外原代培養人子宮腺肌病EMI平滑肌細胞，成功率為100%，為進一步開展分子學機制研究提供了重要基礎?？偨YEMI細胞的培養經驗如下：培養基2~3 d換1次液；細胞按1∶3~1∶4比例傳代；10代內生存活力穩定，3~6代細胞活力最佳。

本研究結果顯示，少腹逐瘀湯能夠抑制EMI細胞的增殖，最佳作用濃度為20 g/L，少腹逐瘀湯干預后的EMI細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。子宮腺肌病的異位內膜侵襲黏附能力強，導致子宮內膜與子宮肌層結合帶異常，被認為是一種增殖性疾病，具備類腫瘤的生物特性。子宮腺肌病的發生發展，與細胞凋亡和增殖失衡有關[7]。本研究結果表明，少腹逐瘀湯可促進EMI細胞凋亡，同時促進EMI細胞增殖。

本研究結果還顯示，少腹逐瘀湯能明顯降低EMI細胞上清E2，EMI細胞PG-E2、ER的水平。子宮腺肌病是一種雌激素依賴性疾病，異位病灶上皮細胞內ER過表達促使異位組織在肌層內種植、生長、發展。基于正反饋機制，E2、PG-E2持續存在于病灶并不斷增加，子宮合成前列腺素（PG）增加，是痛經的重要原因，且痛經的程度與EMI細胞的侵襲深度、血管增生有關[8]。說明子宮腺肌病通過E2與其受體結合激活基因效應及相關通路，同時在血管、炎癥、神經等不同層面產生相應的生物效應，誘導疼痛發生。因此，推斷少腹逐瘀湯通過抑制ER受體表達，同時下調E2、PG-E2水平，進而弱化子宮腺肌病并有效改善痛經。

為了進一步探討少腹逐瘀湯鎮痛的分子機制，本研究檢測了EMI細胞相關致痛因子、炎癥因子、血管生成因子的蛋白表達情況，結果顯示，少腹逐瘀湯干預的EMI細胞IL-6、VEGF、NGF蛋白表達均顯著下降，但NGF指標差異無統計學意義（P＞0.05）。子宮腺肌病是一種慢性免疫炎性疾病，IL-6是子宮腺肌病炎癥病理狀態的主要細胞因子[9]，子宮腺肌病疼痛程度與IL-6有關[10]。VEGF在子宮腺肌病異位、在位內膜中的高表達，提示局部血供豐富和新生血管形成與子宮腺肌病的發病及月經過多有關[11]。另外，有研究表明，子宮腺肌病在位內膜功能層和病灶中NGF的高表達與其痛經程度呈正相關[12]。還有臨床研究表明，子宮腺肌病患者血清NGF水平明顯升高，與痛經強度密切相關[13]?？紤]本研究NGF的檢測結果可能與樣本量少、由于經費受限致購買的抗體不穩定等因素有關；也表明少腹逐瘀湯可以下調EMI細胞的NGF蛋白表達，但并不是其作用的關鍵途徑之一。由于子宮腺肌病的發生發展與E2、ER、PG-E2及IL-6、VEGF關系密切，加之VEGF和PG-E2均有促血管生成，IL-6有促炎反應作用，故推斷少腹逐瘀湯抑制子宮腺肌病EMI細胞主要與抑制雌激素分泌、血管生成、減輕炎癥反應相關。

綜上所述，少腹逐瘀湯可有效促進人EMI細胞凋亡，抑制EMI細胞的增殖，其可能是通過減少雌激素、血管生成因子、炎癥因子的表達，最終改善子宮腺肌病的痛經程度，體現了其中醫“活血化瘀止痛”功效的特點。