血必凈通過高遷移率族蛋白1對熱應(yīng)激神經(jīng)干細(xì)胞的保護(hù)作用研究

李紅波，溫敏勇，羅苑苑，鄭述銘，張先進(jìn)，李春河，曹蕊，王林

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

熱射病是以腦損傷并伴有多器官損害的臨床危重癥。研究報道，1年中熱射病患者的生存率為57%，近30%的存活者出院后仍遺留有神經(jīng)損傷[1]，嚴(yán)重威脅生命健康。因此，探討熱射病的治療機(jī)制具有重要的研究意義。本課題組前期已成功建立熱應(yīng)激神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）模型，并證實NSCs損傷機(jī)制中涉及氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡、自噬等分子信號通路的調(diào)節(jié)[2-3]。我們前期在研究熱應(yīng)激誘導(dǎo)肝損傷的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可促進(jìn)肝細(xì)胞核內(nèi)高遷移率族蛋白1（HMGB1）向胞漿易位[4]。HMGB1是染色質(zhì)相關(guān)核蛋白和細(xì)胞外損傷相關(guān)分子模式（DAMP）分子。既往研究表明，細(xì)胞內(nèi)（胞漿）HMGB1不僅可負(fù)性調(diào)節(jié)哺乳動物和酵母細(xì)胞的外源性（Fas和其他腫瘤壞死因子受體超家族成員和配體）和內(nèi)在（線粒體相關(guān)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)）凋亡途徑，還與自噬的發(fā)生密切相關(guān)。已有報道血必凈注射液治療熱射病可明顯降低炎癥反應(yīng)并縮短住院日[5]。血必凈注射液（簡稱“血必凈”）是中西醫(yī)結(jié)合急救醫(yī)學(xué)奠基人王今達(dá)教授以“三證三法”為辨證原則，以“菌毒并治”理論為指導(dǎo)，以清代王清任血府逐瘀湯組方為基礎(chǔ)，研制而成的中藥復(fù)方靜脈制劑，有降低炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫功能、內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)等作用[6-7]。我們前期亦證實，血必凈可顯著提高熱射病大鼠的存活率及減輕下丘腦的氧化應(yīng)激損傷[8]。為進(jìn)一步探討血必凈是否通過HMGB1誘導(dǎo)自噬發(fā)揮熱應(yīng)激NSCs保護(hù)的分子機(jī)制，從而為臨床救治熱射病提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源大鼠腦NSCs，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供。

1.2 藥物、試劑與儀器血必凈注射液（生產(chǎn)廠家：天津紅日藥業(yè)有限公司；批準(zhǔn)文號：Z20040033）；HMGB1抑制劑——丙酮酸乙酯（Ethyl pyruvate）（江蘇康達(dá)化工有限公司）。DMEM培養(yǎng)基、胰酶（美國Invitrogen Life Technology公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）（武漢博士德生物工程有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的免疫球蛋白（IgG）二抗（美國Invitrogen Life Technology公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、Caspase-3活性檢測試劑盒（美國Biovision公司）；核蛋白/胞漿蛋白提取試劑盒（美國Thermo Scientific公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（博士德公司）；電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測試劑盒（美國Pierce公司）；抗大鼠p62、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、HMGB1、β-actin及Histone單克隆抗體（美國Abcam公司）。DU7400紫外分光光度計（美國Beckman公司）；蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Infinite M1000酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.3 分組與細(xì)胞模型的建立細(xì)胞以1.0×105個/mL密度孵育于培養(yǎng)皿中。實驗分為7組，即陰性對照組、熱應(yīng)激組、非熱應(yīng)激+血必凈組、熱應(yīng)激+血必凈低劑量組、熱應(yīng)激+血必凈中劑量組、熱應(yīng)激+血必凈高劑量組、熱應(yīng)激+HMGB1抑制劑組。以43℃熱應(yīng)激60 min建立熱應(yīng)激模型[2]，作為熱應(yīng)激組。37℃孵育的細(xì)胞作為陰性對照組，陰性對照組細(xì)胞始終置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 藥物預(yù)處理熱應(yīng)激+血必凈低、中、高劑量組NSCs在43℃熱應(yīng)激前分別對應(yīng)用等容積的濃度為5%、15%、25%的血必凈預(yù)處理30 min；熱應(yīng)激+HMGB1抑制劑組NSCs在43℃熱應(yīng)激前分別用等容積的5 mmol/L丙酮酸乙酯預(yù)處理30 min；非熱應(yīng)激+血必凈組37℃正常孵育細(xì)胞，給予等容積的濃度為25%的血必凈預(yù)處理30 min；陰性對照組、熱應(yīng)激組給予等容積的生理鹽水預(yù)處理30 min。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 細(xì)胞活力檢測按照預(yù)設(shè)的復(fù)溫時間點（0、3、6、9 h），在熱應(yīng)激后的不同時間收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和NSCs，采用CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒對各組NSCs活力進(jìn)行檢測。將細(xì)胞以1×103個/mL密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，熱應(yīng)激模型建立后0、3、6、9 h每組加入10 μL CCK-8溶液，孵育1~4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各組細(xì)胞的吸光度值。選擇熱應(yīng)激復(fù)溫合適時間，用于后續(xù)實驗。

1.5.2 Caspase-3活性檢測按照Caspase-3活性檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。取對數(shù)期生長的NSCs給予各處理因素后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液備用，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中；以600×g4℃離心5 min收集細(xì)胞，洗滌，按比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，離心10~15 min，把上清轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中；取少量樣品用Bradford法測定蛋白濃度，盡量使蛋白濃度達(dá)到1~3 mg/mL；加入Ac-DEVD-pNA（2 mmol/L）后混勻，37℃孵育60~120 min，發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時，應(yīng)用紫外分光光度計測定其在405 nm波長處的吸光度值。

1.5.3 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測自噬相關(guān)蛋白p62、LC3、mTOR表達(dá)將NSCs在43℃熱應(yīng)激前用25%濃度的血必凈處理30 min后，用磷酸緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞3次，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液充分裂解細(xì)胞，細(xì)胞刮收集細(xì)胞碎片并離心；用BCA法檢測總蛋白濃度；取等量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，洗滌；轉(zhuǎn)膜1 h；室溫下用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h；分別加入p62、LC3、mTOR等一抗，4℃過夜；洗滌，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h；洗滌后，ECL發(fā)光顯影，分析X線光片上顯影條帶的灰度。使用ImageJ軟件測得各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)量。

1.5.4 HMGB1細(xì)胞組分檢測使用核蛋白/胞漿蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞胞核、胞漿蛋白。提取的細(xì)胞胞核、胞漿蛋白分別采用Western Blot法檢測HMGB1水平，操作步驟同“1.5.3”項。以β-actin作為總蛋白內(nèi)參，Histone作為核蛋白內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計方法采用Graphpad prism 7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間進(jìn)行單因素方差分析，兩組間采用Fisher最小顯著性差異統(tǒng)計檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱應(yīng)激復(fù)溫時間與血必凈劑量的選擇圖1結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，熱應(yīng)激NSCs活力明顯下降，并呈時間依賴性，以第9 h復(fù)溫點細(xì)胞活力下降最低（P＜0.01），見圖1-A；在相同熱應(yīng)激條件下，隨著時間延長，可檢測到細(xì)胞內(nèi)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3活性明顯升高，以熱應(yīng)激復(fù)溫9 h時間點為最高（P＜0.01），見圖1-B。表明熱應(yīng)激復(fù)溫9 h可明顯誘導(dǎo)NSCs活力降低、誘導(dǎo)NSCs發(fā)生細(xì)胞凋亡。因此，采集熱應(yīng)激復(fù)溫9 h時間點的NSCs進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 熱應(yīng)激對NSCs活力及Caspase-3活性的影響Figure 1 Effects of heat stress on NSCs viability and Caspase-3 activity

而給予低、中、高劑量（對應(yīng)濃度5%、15%、25%）血必凈預(yù)處理后，熱應(yīng)激NSCs活力呈劑量依賴性升高，且高濃度25%血必凈預(yù)處理結(jié)果的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2-A；Caspase-3活性呈劑量依賴性下降，且高濃度25%血必凈預(yù)處理結(jié)果的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2-B。故后續(xù)實驗均采用高劑量血必凈進(jìn)行預(yù)處理熱應(yīng)激NSCs。

圖2 血必凈對熱應(yīng)激NSCs活力及Caspase-3活性的影響Figure 2 Effects of Xuebijing on viability of heat stressed NSCs and Caspase-3 activity

2.2 血必凈預(yù)處理可促進(jìn)熱應(yīng)激NSCs自噬我們進(jìn)一步觀察證實，與陰性對照組比較，熱應(yīng)激組細(xì)胞p62、LC3-up水平降低（P＜0.01），p-mTOR、LC3-bottom水平升高（P＜0.01），非熱應(yīng)激+血必凈組p62、LC3-up、p-mTOR、LC3-bottom水平均無顯著性差異（P＞0.05）；與熱應(yīng)激組比較，血必凈處理組p62、LC3-up水平進(jìn)一步下降（P＜0.01），p-mTOR、LC3-bottom水平明顯升高（P＜0.01）；與血必凈處理組比較，HMGB1抑制劑處理組p62、LC3-up、p-mTOR、LC3-bottom水平均無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 血必凈預(yù)處理促進(jìn)腦NSCs自噬Figure 3 Xuebijing pretreatment promots autophagy of brain NSCs

2.3 血必凈預(yù)處理可抑制NSCs凋亡與陰性對照組比較，熱應(yīng)激組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），非熱應(yīng)激+血必凈組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平無顯著性差異（P＞0.05）。給予血必凈預(yù)處理熱應(yīng)激NSCs的結(jié)果顯示，與熱應(yīng)激組比較，血必凈處理組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平明顯下降（P＜0.01）；與血必凈處理組比較，HMGB1抑制劑處理組細(xì)胞Caspase-3表達(dá)水平無顯著性差異（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖4。說明血必凈可能是通過HMGB1抑制細(xì)胞凋亡。

圖4 血必凈預(yù)處理抑制NSCs凋亡Figure 4 Xuebijing pretreatment inhibits apoptosis of NSCs

2.4 血必凈預(yù)處理可促進(jìn)熱應(yīng)激NSCs核內(nèi)的HMGB1向胞漿轉(zhuǎn)位與陰性對照組比較，熱應(yīng)激處理后NSCs的HMGB1細(xì)胞漿表達(dá)量增高（P＜0.01），非熱應(yīng)激+血必凈組HMGB1的胞漿表達(dá)量水平無顯著性差異（P＞0.05）；與熱應(yīng)激組比較，血必凈處理組HMGB1的胞漿表達(dá)量進(jìn)一步升高（P＜0.01）；與血必凈處理組比較，HMGB1抑制劑處理組HMGB1的胞漿表達(dá)量水平無顯著性差異（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖5。

圖5 血必凈預(yù)處理促進(jìn)熱應(yīng)激NSCs核內(nèi)的HMGB1向胞漿易位Figure 5 Xuebijing promotes the cytoplasmic translocation of HMGB1 in the nucleus of heat-stressed NSCs

3 討論

我們前期研究已證實，熱應(yīng)激可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡，NSCs自噬是熱應(yīng)激誘導(dǎo)腦組織損傷過程中存在的另一現(xiàn)象。另外，還有研究證實，熱應(yīng)激大鼠模型的大腦皮層神經(jīng)元及小腦浦肯野細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白在熱應(yīng)激的不同恢復(fù)時間的表達(dá)顯著升高[9-10]。本研究結(jié)果顯示，熱應(yīng)激可引起NSCs自噬相關(guān)蛋白mTOR、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3水平升高（P＜0.01），表明熱應(yīng)激可誘導(dǎo)NSCs發(fā)生自噬。

血必凈的主要有效成分包括紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷及原兒茶醛等。本研究應(yīng)用血必凈處理后可明顯提高熱應(yīng)激NSCs自噬蛋白的表達(dá)水平，而凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3表達(dá)水平明顯下降，提示血必凈可增強(qiáng)自噬并抑制熱應(yīng)激NSCs的凋亡水平。為進(jìn)一步探討血必凈發(fā)揮作用的靶標(biāo)，本研究聚焦HMGB1與自噬的調(diào)控關(guān)系。

Kang和Tang等[11-12]研究證實，HMGB1是一種具有自噬活性的Beclin 1結(jié)合蛋白。正常狀態(tài)下，HMGB1位于細(xì)胞核內(nèi)，在炎癥、創(chuàng)傷、壞死、氧化、高溫和代謝應(yīng)激期間HMGB1可向胞質(zhì)和胞外易位。經(jīng)典的自噬刺激（如雷帕霉素或饑餓）均會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HMGB1易位出核。此外，多種原因引起的腦部損傷，如膿毒癥腦損傷、腦缺血等，亦可導(dǎo)致HMGB1的出核[13-14]。HMGB1出核后，隨即與自噬蛋白Beclin 1相結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的自噬[15]。另外，HMGB1對自噬和凋亡的調(diào)節(jié)依賴于其氧化/還原狀態(tài)，還原型HMGB1可誘導(dǎo)LC3的形成，抑制Beclin 1/Bcl-2之間的相互作用，促使HMGB1與Beclin 1結(jié)合，維持自噬[16]。本研究結(jié)果顯示，熱應(yīng)激處理后NSCs的HMGB1細(xì)胞漿表達(dá)量較陰性對照組增高（P＜0.01）；與熱應(yīng)激組比較，血必凈處理組HMGB1的胞漿表達(dá)量進(jìn)一步升高（P＜0.01）。為明確血必凈是否通過HMGB1增強(qiáng)自噬，我們給予HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯預(yù)處理后，檢測熱應(yīng)激NSCs p-mTOR、LC-bottom等自噬蛋白及Caspase-3表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與血必凈處理組無顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果表明血必凈可能是通過HMGB1而發(fā)揮作用。

為進(jìn)一步明確熱應(yīng)激后HMGB1的細(xì)胞內(nèi)亞定位，我們檢測了熱應(yīng)激神經(jīng)元細(xì)胞核漿中HMGB1的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)血必凈處理后，HMGB1在熱應(yīng)激NSCs中的出核定位顯著升高，丙酮酸乙酯處理后HMGB1的胞漿轉(zhuǎn)位及自噬水平明顯下降，表明血必凈通過促進(jìn)HMGB1出核增強(qiáng)自噬減輕凋亡。

綜上所述，血必凈可以通過促進(jìn)HMGB1出核增強(qiáng)自噬，減少凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)的作用，提示血必凈作為HMGB1的增強(qiáng)劑，在熱射病腦損傷的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景，可為深入研究血必凈的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供新的思路，其進(jìn)一步的分子機(jī)制仍需展開基礎(chǔ)及臨床研究深入探討。