基于王三虎“燥濕相混致癌說”探究半邊蓮治療癌癥的作用及物質基礎

王雪梅，吳凡偉，李彥榮

[1.廣州中醫藥大學，廣東廣州510405；2.深圳市寶安中醫院（集團），廣東深圳518100]

半邊蓮為桔梗科植物半邊蓮Lobelia chinensisLour.的干燥全草，具有清熱解毒、利尿消腫之功效，用于癰腫疔瘡、蛇蟲咬傷、臌脹水腫、濕熱黃疽、濕疹濕瘡等癥[1]，臨床常用于支氣管炎、支氣管肺炎、呼吸道感染和嬰兒腹瀉等的治療[2-4]。半邊蓮喜歡潮濕的環境，分布于我國長江中下游及以南各省區，別名細米草、急解索、半邊花、蛇脷草、長蟲草。近年來，有學者通過各種藥理實驗證實半邊蓮在抗腫瘤、調節內皮細胞、鎮痛消炎、抑制α-葡萄糖苷酶、抗心肌缺血再灌注等方面具有顯著作用，其應用于各種臨床實踐中取得了良好的治療效果[5]。有研究[6-7]報道，半邊蓮的活性成分具有一定的抗癌作用，如何珊等[8]通過觀察半邊蓮生物堿對U266細胞的體外增殖及細胞凋亡的影響，發現半邊蓮可能通過提高癌細胞胞內游離鈣離子濃度而誘導癌細胞凋亡。

陜西省名中醫、廣西省名中醫王三虎教授認為抗癌治療癥狀的消除就是人體的陰陽趨于和諧的表現。王三虎教授認為“風為百病之長”，腫瘤的形成與六氣息息相關，尤其是燥、濕，即燥濕相混是貫穿于某些癌癥始終的矛盾[9]，由此提出了“燥濕相混致癌論”，并以此理論指導使用利水藥牽牛子治療盆腔癌、前列腺癌及結腸癌、直腸癌，均取得良好療效。因此，本研究基于“燥濕相混致癌說”，探討利水消腫中藥半邊蓮治療癌癥的作用。為了進一步探究中醫學利用半邊蓮抗癌的物質基礎并尋找可能的抑制腫瘤細胞生長的活性成分，本研究又對半邊蓮干燥全草進行了系統化學成分分離以及活性研究。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥半邊蓮（采于四川省雅安市），由廣州中醫藥大學附屬深圳市寶安中醫院吳凡偉教授鑒定為桔梗科植物半邊蓮（Lobelia chinensisLour.）全草。

1.2 試劑與儀器反相材料RP-C18（美國Merck公司）；MCI-GEL CHP-20P（三菱化學公司）；柱層析硅膠、薄層層析硅膠（青島海洋化工廠）；凝膠材料Sephadex LH-20（GE保健生物科學）；顯色劑（5%硫酸乙醇溶液、5%香草醛濃硫酸溶液）；半制備C18柱（Agilent SB-C18column 250 mm×9.4 mm，5 mm）；有機溶劑（天津致遠化學試劑有限公司）。RPIM-1640（上海立菲生物技術有限公司）；10%胎牛血清（HyClone）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、順鉑（美國Sigma公司）。全自動旋光儀（Anton-Paar MCP 200）；核磁共振儀（Bruker AV-400-Ⅲ和Bruker AV-500-Ⅲ）；低分辨質譜儀（Agilent 1200 series LC-MS/MS system）；高 分 辨 質 譜 儀（Shimadzu LCMS-IT-TOF）；酶標儀（Thermo）。

1.3 提取與分離將干燥的半邊蓮全草（3 kg）粉碎后，過60目篩，用95%的乙醇（3×60 L）室溫下浸提3次。所得浸提液合并減壓濃縮后得其浸膏，浸膏混懸于1 L水中，再用乙酸乙酯（4×1 L）萃取，濃縮后得到乙酸乙酯部分浸膏（100 g）。乙酸乙酯部分浸膏用石油醚/乙酸乙酯（1∶0，10∶1，3∶1，1∶1，1∶4，0∶1）經由硅膠柱梯度洗脫，洗脫液經薄層板分析后，將表現相近的組分合并，共分離得到4個組分（A~D）。B組分（16 g）用二氯甲烷/甲醇（300∶1~30∶1）經由硅膠柱梯度洗脫得到3個部分（B1~B3）。B2部分（2 g）經由MCI柱，用甲醇/水（30%~100%）洗脫得到4個部分（B2a~B2d）。B2b部分（800 mg）再經過硅膠柱層析得到3個部分（B2b1~B2b3）。其中，B2b2通過高效液相色譜（HPLC）分離得到2個化合物——化合物1（15 mg）、化合物2（10 mg）。B1組分經由RP-C18柱（甲醇/水，40%~90%，v/v）得到3個亞組分（B1a1~B1a3）。B1a3部分通過硅膠柱（石油醚/乙酸乙酯，20∶1~1∶1）分離得到化合物6（12 mg）。B1a2部分通過HPLC分離得到化合物3（8.5 mg）。C組分（1.6 g）用二氯甲烷/乙酸乙酯（200∶1~1∶1）經硅膠柱梯度洗脫得到3個組分（C1~C3）。C1部分經RPC18柱（甲醇/水，50%~100%，v/v）得到4個部分（C1a~C1d）。C1b部分在二氯甲烷/甲醇（1∶1）體系中重結晶得到化合物4（100 mg），剩余部分經硅膠柱（環己烷/乙酸乙酯，4∶1~1∶1）純化得到化合物5（15 mg）。

1.4 化合物抑制癌細胞增殖活性的篩選人乳腺癌細胞MCF-7由中山大學微生物與生化制藥研究室提供；人胃癌細胞MGC-803購自美國保藏中心ATCC。以順鉑作為陽性對照，采用MTT法[10-11]對半邊蓮中分離得到的6個化合物，應用MCF-7和MGC-803細胞模型進行抗癌活性評價。用RPMI-1640、10%胎牛血清、1%的雙抗所配的培養基于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中孵育。96孔板種板前，對細胞計數，每孔2 000~4 000個細胞，每孔100 μL培養基，孵育1 d后，加藥。其中，空白對照組為培養基，陰性對照組為不加藥處理的細胞，加順鉑處理作為陽性對照組。48 h后，加入用磷酸鹽緩沖液（PBS）配制好的5 mg/mL的MTT 20 μL處理4 h，再棄去培養基，每孔加入120 μL DMSO，振蕩10 min，最后用酶標儀測定其在492 nm波長處的吸光度（OD）值。根據OD值計算出各藥物濃度對細胞的抑制率，通過GraphPad Prism軟件，采用非線性回歸計算出各化合物的半數抑制濃度（IC50）值[12]。

2 結果

2.1 提取物結構鑒定化合物1為白色固體，C20H22O6，ESI-MS：m/z359[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH7.53（1H，d，J=8.4 Hz），7.21（1H，d，J=7.8 Hz），7.01（1H，d，J=1.8 Hz），6.95（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz），6.78（1H，d，J=1.8 Hz），6.69（1H，dd，J=8.4，1.8 Hz），4.11（1H，t，J=8.4 Hz），3.87（1H，t，J=9.0 Hz），3.81（3H，s），3.77（3H，s），3.16（1H，dd，J=13.8，5.4 Hz），3.09（1H，dd，J=13.8，6.6 Hz），2.79（1H，ddd，J=9.0，6.6，5.4 Hz），2.73（1H，dd，J=13.8，5.4 Hz），2.62（1H，m），2.51（1H，dd，J=13.6，9.0 Hz）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC178.9（s，C-9），146.8（s，C-3），146.7（s，C-3’），144.7（s，C-4’），144.5（s，C-4），129.9（s，C-1），129.7（s，C-1’），122.2（d，C-6’），121.5（d，C-6），114.5（d，C-5’），114.2（d，C-5），111.6（d，C-2’），111.1（d，C-2），71.5（t，C-9’），56.0（q，OCH3），55.9（q，OCH3），46.7（d，C-8），41.1（d，C-8’），38.5（t，C-7’），34.7（t，C-7）。與文獻研究[13]報道的Matairesinol一致，故結構鑒定為Matairesinol。見圖1。

圖1 化合物1的化學結構Figure 1 Chemical structure of compound 1

化合物2為白色固體，C21H26O6，ESI-MS：m/z375[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH6.79（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），6.77（1H，d，J=8.5 Hz，H-5’），6.59（1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6），6.54（1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6’），6.50（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），6.42（1H，d，J=1.9 Hz，H-2’），4.72（1H，d，J=1.5 Hz，H-9），4.02（1H，dd，J=8.6，7.1 Hz，H-9’a），3.80（3H，s，OMe），3.79（3H，s，OMe），3.65（1H，t，J=8.1 Hz，H-9’b），3.31（3H，s，H-9OMe），2.69（1H，dd，J=13.8，7.4 Hz，H-7a），2.54（2H，d，J=7.3 Hz），2.39（1H，dd，J=13.8，7.4 Hz，H-7’a），2.14（2H，m，H-8），2.14（2H，m）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC146.6（s，C-4’），146.5（s，C-4），144.1（s，C-3），143.9（s，C-3’），132.6（s，C-1’），131.7（s，C-1），121.7（d，C-6），121.3（d，C-6’），114.2（d，C-2’），114.1（d，C-5），111.2（d，C-2），111.1（d，C-5’），110.2（d，C-9），72.3（t，C-9’），55.8（q，OMe），54.9（q，C-9OMe），52.5（d，C-8’），45.9（d，C-8），39.4（t，C-7’），38.9（t，C-7）。與文獻研究[14]報道的（8S，9S，8’S）-4，4’-Dihydroxy-3，3’，9-trimetoxy-9，9’-epoxylignan一致，故結構鑒定為（8S，9S，8’S）-4，4’-Dihydroxy-3，3’，9-trimetoxy-9，9’-epoxylignan。見圖2。

圖2 化合物2的化學結構Figure 2 Chemical structure of compound 2

化合物3為白色固體粉末，C30H50O，ESI-MS：m/z427[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH4.68（2H，s，H-30），3.13（1H，dd，J=5.3，11.5 Hz，H-3），2.56（1H，m，H-21），1.85（1H，m，H-7a），1.73（1H，m，H-20a），1.65（3H，s，H-29），1.60（1H，m，H-2a），1.50（4H，m，H-2b，16a，19a，20b），1.42（1H，m，H-6a），1.36（2H，m，H-11a，16b），1.30（5H，m，H-1，12，17），1.24（2H，m，H-5，13），1.21（2H，m，H-15），1.20（5H，m，H-6b，7b，26），0.92（2H，m，H-11b，19b），0.88（3H，s，H-23），0.79（3H，s，H-25），0.77（3H，s，H-27），0.68（3H，s，H-28），0.60（3H，s，H-24）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC33.3（t，C-1），29.3（t，C-2），79.4（d，C-3），39.3（s，C-4），48.1（d，C-5），19.2（t，C-6），35.0（t，C-7），43.2（s，C-8），46.1（d，C-9），37.1（s，C-10），22.6（t，C-11），24.5（t，C-12），49.9（d，C-13），41.8（s，C-14），33.8（t，C-15），21.6（t，C-16），55.3（d，C-17），45.0（s，C-18），41.9（t，C-19），27.5（t，C-20），46.6（d，C-21），148.9（s，C-22），29.2（q，C-23），16.1（q，C-24），22.8（q，C-25），22.8（q，C-26），17.3（q，C-27），16.3（q，C-28），25.2（q，C-29），110.2（t，C-30）。以上波譜數據與相關文獻研究[15]報道的3β-hydroxyhop-22（29）-ene基本一致，故鑒定化合物3為3β-hydroxyhop-22（29）-ene。見圖3。

圖3 化合物3的化學結構Figure 3 Chemical structure of compound 3

化合物4為黃色粉末，C16H12O5，ESI-MS：m/z285[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH12.29（1H，s，OH-1），12.19（1H，s，OH-11），7.61（1H，s，H-4），7.35（1H，d，J=2.5 Hz，H-8），7.06（1H，s，H-2），6.67（1H，d，J=2.5 Hz，H-10），3.92（3H，s，CH3O-9），2.43（3H，s，H-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC162.7（s，C-1），124.7（d，C-2），148.7（s，C-3），121.5（d，C-4），135.5（s，C-5），182.3（s，C-6），133.4（s，C-7），108.5（d，C-8），166.8（s，C-9），107.0（d，C-10），165.4（s，C-11），110.5（s，C-12），191.0（s，C-13），113.9（s，C-14），22.4（q，C-15），56.3（q，CH3O-9）。與文獻研究[16]報道的化合物parietin一致，故結構鑒定為parietin。見圖4。

圖4 化合物4的化學結構Figure 4 Chemical structure of compound 4

化合物5為黃色粉末，C15H10O4，ESI-MS：m/z255[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH 12.09（1H，s，OH-1），11.98（1H，s，OH-11），7.80（1H，dd，J=8.3，1.1 Hz，H-8），7.65（1H，br d，J=8.3 Hz，H-9），7.63（1H，br s，H-4），7.27（1H，d，J=8.3，1.1 Hz，H-10），7.06（1H，s，H-2），2.44（3H，s，H-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC162.9（s，C-1），124.8（d，C-2），149.6（s，C-3），121.6（d，C-4），133.9（s，C-5），182.2（s，C-6），133.5（s，C-7），120.2（d，C-8），137.2（d，C-9），124.6（d，C-10），162.6（s，C-11），114.0（s，C-12），192.08（s，C-13），116.1（s，C-14），22.5（q，C-15）。與文獻研究[17]報道的化合物chrysophanol一致，故結構鑒定為chrysophanol。見圖5。

圖5 化合物5的化學結構Figure 5 Chemical structure of compound 5

化合物6白色固體，C16H18O4，ESI-MS：m/z275[M+H]+；1H NMR（400 MHz，CDCl3）δH5.01（1H，d，J=17.5 Hz），4.85（1H，d，J=17.5 Hz），3.85（1H，d，J=11.5 Hz），3.47（1H，d，J=11.5 Hz），2.73（1H，m），2.47（1H，m），2.28（1H，m），1.90（1H，m），1.84（1H，m），1.70（1H，m），1.38（1H，m），1.30（1H，m），1.22（3H，s），0.82（3H，s）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δC181.0（s，C-14），163.8（s，C-12），158.9（s，C-8），132.4（s，C-7），121.9（d，C-11），111.9（d，C-9），71.4（d，C-6），69.7（t，C-13），47.9（d，C-5），42.9（s，C-4），35.2（s，C-10），29.7（t，C-1），27.8（t，C-3），24.9（q，C-16），24.2（q，C-15），17.5（t，C-2）。與文獻研究[18]報道的gaultheriadiolide一致，故結構鑒定為gaultheriadiolide。見圖6。

圖6 化合物6的化學結構Figure 6 Chemical structure of compound 6

2.2 化合物抑制癌細胞增殖活性篩選結果結果如圖7所示，在20 μmol/L濃度下，化合物1和2抑制MCF-7和MGC-803細胞增殖率大于50%。因此，繼續對這2個化合物抑制細胞增殖的IC50進行測試。

圖7 半邊蓮中分離化合物（1~6）對MCF-7（A）和MGC-803（B）細胞的抑制活性Figure 7 The inhibitory activity of compounds（1-6）isolated from Lobelia on MCF-7 and MGC-803 cells

活性測試結果發現，化合物1、2具有顯著的抑制乳腺癌細胞和胃癌細胞增殖活性，其IC50值如表1所示。

表1 半邊蓮中分離化合物1和化合物2對MCF-7和MGC-803細胞增殖活性的IC50值Table 1 The IC50 value of compound 1 and compound 2 isolated from Lobelia chinensis Lour.on the viability of MCF-7 and MGC-803 cells （±s）

表1 半邊蓮中分離化合物1和化合物2對MCF-7和MGC-803細胞增殖活性的IC50值Table 1 The IC50 value of compound 1 and compound 2 isolated from Lobelia chinensis Lour.on the viability of MCF-7 and MGC-803 cells （±s）

化合物順鉑化合物1化合物2 IC50/（μmol·L-1）MCF-7 8.6±0.4 15.1±0.9 18.7±0.6 MGC-803 6.4±0.2 13.4±1.4 9.2±0.8

3 討論

癌病是多種惡性腫瘤的總稱，以臟腑組織發生異常增生為特征。中醫學上稱癌癥為“癥瘕”“積聚”等，如《諸病源候論·卷之十九》曰：“積聚者，乃由陰陽不和，臟腑虛弱，受于風邪，搏于臟腑之氣所為也。”腫瘤是嚴重威脅人類健康的重大疑難疾病之一，根據最新的全球腫瘤數據統計，2018年全球新增腫瘤病例1 810萬，970萬腫瘤患者死亡，2020年腫瘤成為人類健康的“頭號殺手”[19]。中醫藥治療腫瘤的歷史悠久，據相關統計，服用中藥治療惡性腫瘤的患者有三分之二以上[20]，因此，對抗腫瘤中藥的再研究與開發具有重要的理論和現實意義。

本研究結果顯示，從中藥半邊蓮的乙醇提取物中分離鑒定了6個化合物，其中化合物1、2、6為木脂素類，化合物3為三萜類，化合物4、5為黃酮類。對分離得到的所有化合物進行癌細胞毒活性測試以評價其抗癌活性，發現化合物1、2具有潛在的抗胃癌和乳腺癌活性（濃度為20 μmol/L時，其抑制率大于50%），其中化合物2對MGC-803細胞增殖活性的IC50為9.2 μmol/L。

另外，本研究發現，中藥半邊蓮發揮抗癌活性作用的可能為木脂素類化合物，初步闡明了半邊蓮抗癌活性的物質基礎，為基于“燥濕相混致癌說”探究中藥半邊蓮在治療癌癥的作用及物質基礎提供了依據。

綜上所述，通過對半邊蓮抗癌活性成分的深入研究，可以為低毒高效的抗癌新藥研發提供實驗依據。有關半邊蓮抗癌作用物質基礎的研究仍有待進一步深入開展。