顯微鏡下多血管炎患者外周血髓樣樹突狀細胞和調(diào)節(jié)性T細胞的表達及意義

丁秋燕，汪 偉，羅昊軍，李 怡，丁涵露

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 成都 610072 ；2.四川省自貢市第四人民醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 自貢 643000)

目前抗中性粒細胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis，AAV)的病死率仍然較高，血清中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)抗體和蛋白酶3(proteinase 3，PR3)抗體是抗中性粒細胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)的主要類型[1]。AAV腎損傷病理類型分為局灶性、新月體性、混合性和硬化性[2]，不同腎組織病理損傷的發(fā)生機制不清楚。我國原發(fā)性AAV中多血管炎(MPA)最常見，約占80%[1]。髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cell，mDC)通過調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)等細胞的功能參與AAV的發(fā)病[3,4]，目前把Lin1-HLA-DR+CD11c+細胞定義為mDC，以CD4+CD25highCD127lowTreg細胞代表Treg細胞[5]，有報道AAV患者外周血DC表達下降[6]，但MPA患者外周血mDC、Treg細胞表達變化及其與伯明翰血管炎活動性評分(BVAS)、腎組織病理類型之間的關(guān)系不清楚。故本文擬對比觀察活動期、緩解期MPA患者外周血mDC、Treg 細胞水平及其與BVAS評分、腎組織病理類型之間的關(guān)系，以期為MPA的發(fā)病機制和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年4月四川省人民醫(yī)院確診的45例MPA患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2012年Chapel Hill共識會議制定的《顯微鏡下多血管炎診斷及治療指南》關(guān)于MPA的定義[7]；②初次診斷為原發(fā)性MPA、沒有進行糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療；③血清P-ANCA抗體和MPO抗體均陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并PR3-ACNA陽性及其他繼發(fā)性腎病的患者。男23例，女22例，年齡15～71歲[(45±26)歲]。選擇同期健康志愿者15例，男8例，女7例，年齡24～68歲[(57±15)歲]。本研究獲得我院倫理委員會審查批準(zhǔn)(編號：2020393)，患者簽署臨床標(biāo)本收集檢測知情同意書。患者的BVAS評分按照文獻計分，總分63分，15分以上為活躍，小于15分為緩解[8]。活躍組27例，緩解組18例。MPA患者中24例行腎穿刺病理檢查，以WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)進行MPA患者的病理診斷[2]，其中局灶性12例，新月體性5例，混合性7例。

1.2 實驗材料CD4 APC-Cy7(557871)、CD25-BB700(566447)、CD127 PE-Cy7(560822)、Lineage cocktail 1 (lin 1,由CD3, CD14, CD16, CD19,CD20, CD56系列抗原混合單克隆抗體組成)(340546)、CD11C PE-Cy7(561356)、HLA-DR APC(560896)、IgG1 APC-Cy7(557873)、IgG1 BB700(566404)、IgG1 PE-Cy7(557872)、IgG2a APC(555576)，以上試劑來自BD公司。流式細胞儀為BD FACS CantoTM II。

1.3 外周血mDC細胞和CD4+CD25highCD127lowTreg細胞檢測外周血中mDC/Treg數(shù)量檢測采用全血單抗直接標(biāo)記-溶血法；4.5 ml紅細胞裂解液加至1.5 ml肝素抗凝全血，離心后向細胞沉淀中加入3 ml紅細胞裂解液，PBS重懸細胞至200 μl,混勻后將細胞液移到試管，再以無菌PBS重懸至200 μl，取其中100 μl沉淀細胞加入Lin1-FITC抗體 4 μl、HLA-DR-APC抗體4 μl、CD11c-PE-cy7抗體2 μl，取上述另外100 ul沉淀細胞加入CD4-APC-Cy7抗體2 μl、CD25-BB700抗體5 μl，CD127-PE-Cy7抗體5 μl混勻，上述細胞和抗體的混勻液分別避光冰浴30分鐘后加入無菌PBS 洗滌、離心、去上清液，然后每管細胞液用500 μl PBS重懸細胞,以 BD FACS CantoTM II流式細胞儀對上述細胞懸液進行檢測。應(yīng)用前向散射角與側(cè)向散射角進行設(shè)門去除死細胞和細胞碎片排除碎片干擾。以側(cè)向散射角和Lin1設(shè)門選擇Lin1陰性細胞,分析mDC占外周血淋巴細胞的百分比，mDC細胞以Lin1-HLA-DR+CD11c+DC占外周血淋巴細胞的比例表示；以側(cè)向散射角和CD4設(shè)門選擇CD4陽性細胞，分析CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占CD4+細胞的百分比，Treg細胞以CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占CD4+淋巴細胞的比例表示。分別加入同型鼠單抗IgG1-APC-Cy7/IgG1- BB700/IgG1-PE-cy7，IgG2a-APC/IgG1PE-cy7作為陰性對照。上述結(jié)果分析均應(yīng)用Diva軟件。mDC細胞和Treg細胞設(shè)門見圖1，圖2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和t檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活躍組與緩解組臨床資料比較活躍組與緩解組白細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血壓和血白蛋白等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，活躍組血肌酐和血MPO抗體滴度較緩解組更高，血紅蛋白較緩解組更低(P<0.05)，見表1。

圖1 MPA患者外周血mDC占外周血淋巴細胞的比例 a：淋巴細胞在外周血中的百分比；b：Lin1陰性細胞在淋巴細胞中的百分比；c：HLA-DR和CD11c雙陽性的細胞在Lin1陰性細胞中的百分比

表1 活躍期組與緩解期組臨床資料比較

2.2 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg細胞表達量及其與BVAS評分關(guān)系與緩解組及健康對照組比較，活躍組mDC占外周血淋巴細胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占外周血CD4+細胞的百分比均下降(P<0.05)，緩解組及健康對照組上述細胞表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。mDC占外周血淋巴細胞的百分比、外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占CD4+細胞的百分比與BVAS評分均呈負相關(guān)(r分別為-0.64、-0.71，P<0.05)。

表2 MPA患者外周血mDC占比、CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占比表達水平比較 (%)

2.3 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg細胞與腎組織病理類型的關(guān)系新月體性組與局灶性組、混合性組比較，BVAS評分明顯升高，mDC占外周血淋巴細胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占外周血CD4+細胞的百分比均下降(P<0.05)；局灶性組與混合性組比較，外周血mDC與CD4+CD25highCD127lowTreg細胞胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 MPA患者外周血mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg細胞、BVAS評分比較

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)活躍組白細胞、淋巴細胞與緩解組無差異，但血肌酐和血MPO抗體滴度較緩解組更高而血色素更低，由于活躍組外周血mDC占淋巴細胞的百分比、CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占CD4+細胞的百分比均較緩解組下降，且mDC、CD4+CD25highCD127lowTreg細胞數(shù)均與BVAS評分負相關(guān)，提示mDC和Treg細胞參與了MPA發(fā)病。

按照來源可把樹突狀細胞分為髓樣DC(mDC)和淋巴樣DC(pDC)，mDC主要位于外周血、腎、胃腸、皮膚黏膜、脾臟以及淋巴結(jié)等部位，研究發(fā)現(xiàn)AAV緩解期和急性期外周血mDC和pDC均是表達下降的[6]，CD11c主要表達在mDC上[9]，故本文以CD11c標(biāo)記mDC細胞檢測外周血mDC細胞表達。本文發(fā)現(xiàn)，與緩解組及健康對照組比較，MPA活躍組患者外周血mDC占淋巴細胞的百分比均下降，且其表達量與患者BVAS評分負相關(guān)。緩解組和健康對照組的mDC占淋巴細胞百分比相比無差異。外周血mDC表達量下降可能與骨髓祖細胞分化為樹突狀細胞減少有關(guān)，也可能與mDC促進CD4+T細胞分化為Th17細胞增多而分化為Treg細胞減少，導(dǎo)致腎組織炎癥介質(zhì)表達失衡，mDC從血液中轉(zhuǎn)移到腎臟中有關(guān)，文獻報道遷移至腎組織的DC攝取抗原后在腎組織局部或經(jīng)5過淋巴、血液移行到淋巴組織富含T細胞的區(qū)域并提呈相應(yīng)抗原給T細胞、活化致病T細胞而加重體內(nèi)炎癥損傷[9～11]，可見DC在AAV發(fā)病中具有重要作用。

核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(Foxp3)具有調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞生長、發(fā)育的作用，因此目前把Foxp3作為調(diào)節(jié)性T細胞的標(biāo)記物。然而由于Foxp3表達在細胞內(nèi)，需要經(jīng)過固定、破膜等一系列步驟后方可對其進行染色、檢測，這在很大程度上有可能對結(jié)果的重復(fù)性、準(zhǔn)確性造成干擾，所以用 CD4、CD25和 Foxp3聯(lián)合標(biāo)記調(diào)節(jié)性T細胞的可行性較差。有文獻報道CD127在非調(diào)節(jié)性T細胞高表達而在調(diào)節(jié)性T細胞表面是低表達的，通過CD4+CD25highCD127lowTreg選定的細胞與表達FOXP3的調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量相近，并且CD4+CD25highCD127lowTreg細胞的特性與CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞是一致的[5]，因此本文用CD127聯(lián)合CD4、CD25檢測Treg細胞, 具有代表CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞表達水平的作用，同時可以保持細胞的完整性和結(jié)果的可重復(fù)性。CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞是抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)、維持自身免疫耐受的重要細胞,CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞細胞通過抑制炎癥因子的釋放減少中性粒細胞的活化并減輕效應(yīng)記憶T細胞對血管壁的破壞[12]。有研究發(fā)現(xiàn)相對于健康者，AAV患者CD4+CD25highFoxp3+Treg細胞雖然數(shù)量是增加的，但其抑制炎癥反應(yīng)的功能下降[13]，有研究發(fā)現(xiàn)，AAV患者外周血活性Treg細胞表達下降[11]，本文發(fā)現(xiàn)，與緩解組及健康對照組比較，活躍組外周血CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占CD4+細胞的百分比下降，且其表達量與患者BVAS評分負相關(guān)，推測下降的CD4+CD25highCD127lowTreg細胞不能抑制體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而加重血管炎的活躍度。

AAV患者的腎損傷臨床表現(xiàn)輕重不一、腎病進展也有快有慢，其臨床表現(xiàn)的多樣性可能與其病理損傷類型的多樣化有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)病理損傷類型有助于指導(dǎo)臨床治療并預(yù)測腎臟結(jié)局[2]。腎功能最好的是局灶性病變，最差的是硬化性病變[14]，但MPA不同病理類型的發(fā)生發(fā)展機制不清楚。本文入選的MPA患者有53.3%的患者行腎穿刺病理檢查，50%的腎穿刺患者表現(xiàn)為局灶性，新月體性和混合性的占比分別為20.8%和29.2%，局灶性和混合性組的患者BVAS評分相對于新月體性組均有下降，與此相對應(yīng)的是，新月體性組外周血mDC占淋巴細胞的百分比和CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占CD4+細胞百分比均局灶性組、混合性組下降，而局灶性組與混合性組比較，其外周血mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg細胞占比水平無差異，該結(jié)果提示mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg細胞數(shù)下降可能參與了腎組織的急性病理損傷。

綜上，本文發(fā)現(xiàn)MPA患者外周血mDC和CD4+CD25highCD127lowTreg細胞下降與疾病活躍度及腎組織急性病理損傷有關(guān)。由于入選患者樣本量較少，下一步需要增加樣本量進行實驗結(jié)果的進一步驗證，同時mDC細胞與CD4+CD25highCD127lowTreg細胞相互作用導(dǎo)致MPA病變進展的機制有待研究。