羊肚菌單孢和多孢菌株大田出菇比較試驗

羅友梅 陳瑞雅 張銳杰 李銳新 余佳蝶 賀新生

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

羊肚菌是羊肚菌屬Morchella的食藥兼用真菌，是我國近十年來發展迅速的食用菌栽培品種之一。其人工栽培技術得到不斷的改進和提高，而出菇和農藝性狀不穩定則制約著產業的發展[1]。

我國已經發現羊肚菌屬有60多個物種[2]，其中大規模商業化栽培的主要為：六妹羊肚菌Morchella sextelata，七妹羊肚菌M. eximia和梯棱羊肚菌M. importuna等[3]。羊肚菌規模化生產的風險極大，大多數共生型的物種人工栽培無法出菇；腐生型的物種若分離方法不當，得到的菌株也不會出菇；大田開放式種植，遇極端高溫或風霜雨雪凍等環境條件無法抗御，導致大面積絕收；病蟲害日益增多，致使羊肚菌生產每年都有30%～50%的面積減產和絕收，給投資者和生產者造成了極大的經濟損失[4,5]。

對羊肚菌單孢菌株及多孢菌株栽培種的制作過程、栽培過程、產量和品質進行比較研究，可以得到高產及品質相對穩定的優良菌株，為羊肚菌種植業的發展提供更多的理論依據和技術支持。

1 試驗背景

羊肚菌菌株的分離方法有組織分離法和孢子分離法。業內大多采用組織分離法。但該方法獲得的純種可能出現交配型基因缺失現象[6]，無法完全將子實體內外表面膨大細胞與緊密內組織細胞分開；而膨大細胞萌發的菌絲無繁殖能力，從而導致減產、絕收。對子實體組織分離與孢子分離兩種方法獲得的羊肚菌菌株進行比較試驗的結果：孢子分離的萌發率較組織分離的萌發率高，分別為90%和80%[7]。用孢子分離法，菌絲在母種培養基上生長快，長勢強，在綜合培養基上生長慢而弱[8]；用組織分離法，無論是采用母種基質還是綜合基質，生長速度都較慢，菌絲的顏色、長勢等都較孢子分離法差[1,7,9]。

遺傳類型屬于同宗結合的物種，單孢可以出菇，如次級同宗結合類型的雙孢蘑菇Agaricus bisporus。采用單孢出菇的方法篩選出不出菇的單核單孢菌株進行雜交育種，可得到具有明顯雜交優勢的新菌株。如草菇Volvariella volvacea是初級同宗結合的遺傳類型，通過單孢出菇試驗可獲得出菇性能優良的新菌株[10]。羊肚菌的孢子有30～50個細胞核，屬于多核體，是單孢可孕的遺傳類型，同一個孢子萌發的菌絲相互接觸融合（自融合）是其生長發育成子實體至關重要的步驟。而不同孢子萌發出來的菌絲會發生大量的相互纏繞、自身卷曲、相互打結等現象，無法正常融合甚至發生死亡，導致在栽培過程中出現產量、性狀和質量等不穩定問題，采用單孢分離方式可有效避開這一問題[1,11,12]。單孢菌株的形態、質量均較一致，多孢分離物、混合播種的子實體形態變化大、同一栽培基地同樣栽培方法的產量差異顯著。

單孢可以出菇的物種不是一般意義上的異宗結合類物種，大量研究表明栽培的羊肚菌種類完全可以實現單孢正常出菇，并獲得高產[11,12]。本試驗采用多孢混種培養，在培養皿內的菌絲生長末端切取單根菌絲轉接至新的培養基上，獲得純化的單孢菌絲進而分離單孢的方法來制備栽培用菌株。對廣泛栽培的六妹羊肚菌和梯棱羊肚菌進行單、多孢菌株大田出菇對比試驗，以驗證其出菇的穩定性，篩選產量高的新菌株，為今后羊肚菌栽培新菌株的選育研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 供試菌株

梯棱羊肚菌：MT-7；六妹羊肚菌：M-90、M-925、M-1080。原始菌株保存在西南科技大學生命科學與工程學院菌物資源開發利用研究室。

2.2 試驗培養基和營養袋制作

（1）平板培養基。配方為蔗糖20 g、玉米粉5 g、蛋白胨1 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，pH 6.5，各原料混合后加熱融化，轉移至錐形瓶中與培養皿一起高壓蒸汽滅菌，滅菌完成后冷卻至45 ℃倒平板，待凝固后倒置備用。

（2）斜面培養基。配方為蔗糖20 g、瓊脂20 g， KNO30.5 g、水1 000 mL，pH 6.5。各原料混合后加熱融化，分裝至小試管中，121 ℃高壓滅菌20 min，滅菌完成將試管斜置，待其凝固。

（3）栽培種固體培養基。配方為小麥75 g，木屑23 g，石膏1 g，生石灰1 g。小麥浸泡24 h左右或煮漲至掰開查看無白色物質后，瀝干明水，按比例加入干燥木屑、石膏、生石灰拌勻，將水分控制在63%～65%后裝袋。采用500～750 mL的菌種袋，每袋裝培養料600 g，松緊適度，于121 ℃ 滅菌60 min。

（4）營養袋。制作方法與栽培種培養基一致，將原料按配方混勻后，含水量控制在55%～60%，即可裝料。裝好的營養袋使用專門的橡皮筋扎口，121 ℃下滅菌60 min，冷卻備用。

2.3 制備單孢培養物

按照龔國淑等[13]的單孢分離方法，切取培養皿邊緣最稀疏處的單根菌絲，轉接到試管中，獲得純化的單孢菌絲，對單孢菌株分別進行編號，培養過程淘汰被污染和菌絲形態異常的試管。共獲得54個單孢菌株，其中M-90有14個單孢菌株，M-925有10個，M-1018有13個，MT-7有17個（表1）。

2.4 制備多孢培養物

按鄭國揚的方法[14]進行孢子彈射，用接種針蘸取少量的羊肚菌孢子，在平板上連續劃線，標記不同的菌株，置于25 ℃培養箱培養并觀察生長狀態，在培養過程中，對被污染和菌絲形態異常的培養皿予以淘汰，獲得多孢菌株15個（表1）。

表1 菌株的編號

2.5 栽培種制備

在滅好菌的菌種袋中接種等量菌絲體，得到單孢和多孢栽培種。20～25 ℃條件下避光培養，每隔24 h用四角法記錄菌絲生長長度。

2.6 大田栽培試驗

栽培過程分6個步驟：試驗用地的前期準備→播種→平棚和小拱棚的搭建→營養袋的擺放→菌絲營養生長階段的水分和溫度管理→出菇階段管理[1,4,5]。

（1）前期準備。試驗栽培用地為一塊矩形荒地，在下種前一個月進行機械除草、翻耕（深翻）、曝曬和撒生石灰處理，生石灰用量為25～50 kg/667m2，再次翻耕（淺翻）。在試驗用地內建畦，畦面寬1 m，作業走道寬25 cm，畦面上橫向每隔0.5 m挖淺溝，使畦面分布面積為0.5 m2的小區，作為菌株的試驗小區。

（2）播種。土壤含水量在20%以下，手搓土條不黏手，可以播種。土條黏手、土面或溝內有明水的田塊，土壤含水量超過22%，不能下種[16]。用經消毒的鐵勺將菌種瓶中的菌種掏出，倒入盆中用手搓散，然后均勻地撒在對應的畦塊上，播種量按照0.5 kg/m2進行，播種完成后插標簽。每菌株隨機播種3個小區，即3個重復。

（3）搭棚。試驗田內按3×3（m）的規格打深30 cm的孔洞，插入作為支架的2 m長竹竿，竹竿上部綁小竹竿搭建棚頂，并蓋上6針的遮陽網，簡易平棚即搭建完成。小拱棚的搭建采用長1.8～2.0 m的竹篾，在田畦上以間距1 m逐根插入土中，再蓋上黑膜即可。

（4）生長管理。在播種后4～7天用噴水的方式對全部田畦澆水，使土壤含水量保持在20%左右，檢測標準是手搓土基本能成不斷裂的條，此時土壤含水量為18～20%。土壤含水量不能超過21%，若土壤手搓黏手，則需通風3～7天。

播種后7～20天，擺放營養袋，用量為8～9個/m2。出菇前20天進行撤袋、催菇操作。在立春后，溫度上升至能夠穩定在8 ℃以上時，原基開始形成，需要提前澆水使土壤含水量維持在21%～23%，保證有充足的水分供子實體形成和生長。記錄出菇時間、出菇密度、出菇時土壤及環境溫度、菇形及總重量。幼嫩的子實體為黑灰色，成熟后顏色變淡，當鮮菇的傘蓋長度為3～5 cm，不超過7 cm，菌柄長度為3～5 cm，子實體整體長度不超過12 cm時采收。

3 結果與分析

3.1 單孢和多孢菌株在菌種袋中的菌絲生長情況

根據各菌株在菌種袋中的菌絲生長情況繪制生長曲線，結果如表2所示：除A+A菌株因生長緩慢，導致難以記錄生長曲線而缺趨勢線外，其余各菌株生長的趨勢線分別為多項式、對數、線性、乘冪，表明隨培養時間延長，氧氣的缺少對不同菌株的影響程度不同。

表2 菌株的相關系數和對應的趨勢線

菌絲生長在正常條件下初期為線性增長，無色、白色；隨著培養時間延長，生長速率減慢，越靠近菌袋底部生長速率越慢；當菌絲長至菌袋底部后，菌絲顏色逐漸加深至淺黃白色、淺黃色；最終菌絲之間相互纏繞長出菌核，使栽培種呈現紅褐色。而菌株A、A+D、B+D、D+D所制備的栽培種菌絲生長為線性增長，可看出氧氣的減少對這4個菌株的抑制作用小于其他菌株。試驗過程中，C菌株的栽培種出現大量被污染的現象，并且未見菌絲顏色進一步轉變。

3.2 單孢和多孢菌株出菇密度及形態

（1）單孢菌株。各單孢菌株子實體形態見圖1，菌株A、B的菇形偏矮小，菌柄較短，但B菌株子實體較A菌株的細長。C菌株雖有出菇，但子實體出現了大面積染病情況，形態短小，菌蓋上下比例不協調，出菇效果不佳。A、B、C菌株出菇密度均低。D菌株子實體呈現淡紫色，中等大小，菌蓋與菌柄直徑相近，但菌柄偏長，出菇密度為中等，較適宜在生產中應用[1,15]。

圖1 不同單孢菌株出菇形態

（2）多孢菌株。從菇體形態看，雖然A9單孢菌株可以正常出菇，但多孢菌株中產量最高的D10+A9菌株（表3），所出的子實體只有D菌株子實體。A6單孢菌株出菇污染較少，而C17+A6菌株污染嚴重，且出菇大多為A6菌株。由此可見單孢菌株構成多孢菌株后，其自身的出菇能力受到影響。

此外，C17+D7+B8菌株所出的子實體中無C菌株的子實體，而有B、D菌株子實體，可見針對單孢菌株敗育影響出菇的情況，采取多孢育種反而具有一定的優勢。

3.3 單孢和多孢菌株的產量

試驗結果（表3）表明，單孢菌株、多孢同種菌株和多孢不同種菌株之間的產量不同。單孢菌株中A7、A11、C15產量為0，菌株D7、B1、D4、D10產量較高，0.5 m2小區產量分別為400 g、365 g、350 g和310 g。A菌株大部分產量偏低，平均產量僅35.83 g，而D菌株大部分產量偏高，平均產量達116.67 g，C菌株普遍出現污染。因此，總體上以D菌株產量較高、出菇效果良好。

表3 單、多孢菌株小區鮮菇平均產量

多孢菌株中，D10+A9、B5+D5、D4+D2+D3及B10+D6+D12產量較高，0.5 m2小區產量分別為260 g、175 g、125 g和115 g，總體上低于單孢菌株產量；C14+A8、C14+A4、A10+A11產量為0，但構成其的單孢菌株A4、A8、A10，都可正常出菇。D菌株的多孢菌株均呈現減產趨勢，表明多孢菌株可能會對高產品種的產量產生負面效應。

4 小結與討論

試驗結果表明，在通氣不良的情況下，菌株A、A+D、B+D、D+D在制備的栽培種固體培養基中，菌絲生長前期均為線性增長，較其他菌株受影響小。在出菇效果比較試驗中，不同單孢菌株存在較大差異，其中以菌株D（M-1080）表現較好，子實體呈淡紫色，中等大小，菇形較好，出菇密度中等，而菌株A、B、C子實體稀疏，產量低，不宜用于生產。

D菌株單孢菌株、多孢同種和不同種菌株之間的產量差異大，有多孢減產的趨勢；另有多孢菌株C14+A4、C14+A8、A10+A11未出菇，但構成其單孢菌株A4、A8、A10都可正常出菇。由此我們推斷育種或菌種生產中多孢菌株的出現可能會對產量產生負面的影響。

綜上所述，在羊肚菌大規模生產中，要提前選育高產及品質相對穩定的羊肚菌優良菌株。其次，由于不同菌株之間差異顯著，播種及菌種生產過程要注意避免不同菌株的人為混合情況，以免得到多孢菌株，對產量造成負面影響。本試驗初步得到單孢菌株D7為一優勢菌株，但還需要進一步研究和進行生產性試驗，以確定單孢分離菌株的出菇性能和產量的穩定性。

此外，在羊肚菌種植過程中還要注意用水時機、用水量、溫度和濕度等，在保證菌種優良的條件下，最大限度地出好菇，實現優質、高產。