培養(yǎng)基種類與桑黃菌絲生長及黃酮含量的關(guān)系研究

李秀娥 鄭巧佳 張 蕊 劉 偉 吳其平 李維煥 程顯好*

（1. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2. 山東利農(nóng)菌業(yè)有限公司，山東 東營 257442）

桑黃（Sanghuangporus vanini）隸屬擔(dān)子菌亞門Basidiomycota、層菌綱Hymenomycetes、非褶菌目Polyporales、多孔菌科Polyporaceae、桑黃孔菌屬Sanghuangporus。其子實(shí)體味微苦，可入藥，利五臟、軟堅(jiān)、排毒、止血、活血，民間常用以治療淋病、崩漏帶下、瘡窟積聚、癖軟、脾虛泄瀉[1-3]。學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，桑黃子實(shí)體提取物具備非常好的抗癌效果，對(duì)正常細(xì)胞無毒害作用[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，桑黃提取物對(duì)小鼠肝癌 H22、肉瘤S180、肺癌 Lewis、乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、人源性結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29等均有良好的抗性，且具有一定的降血糖活性和增強(qiáng)人體免疫力、保肝、治療關(guān)節(jié)炎等功效[5-8]。近年來的研究表明，桑黃活性成分主要包括多糖類、黃酮類、酚類、萜類、甾體、香豆素類及生物堿等[9]。其中黃酮類化合物是桑黃中含量較高的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，在子實(shí)體和菌絲體中均有分布[10]。隨著食藥用菌產(chǎn)業(yè)與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的結(jié)合發(fā)展，目前國內(nèi)已有少數(shù)機(jī)構(gòu)和企業(yè)實(shí)現(xiàn)桑黃的人工栽培。如何提高人工栽培桑黃中的有效成分含量逐漸成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。黃酮和多糖是桑黃中最重要、也是研究最多的活性成分，其含量高低決定著桑黃的價(jià)值[11,12]。

本研究通過觀察分析在不同培養(yǎng)基上生長的桑黃菌絲體形態(tài)及黃酮產(chǎn)量，篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基，并探討黃酮的產(chǎn)生規(guī)律，以期用于高黃酮含量的桑黃生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃菌株LDP1902，為吉林省長春市野外采集所得。

1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀、瓊脂、硼酸、乙酸鈉、乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、玉米漿，試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3 儀器

紫外分光光度計(jì)、高頻數(shù)控超聲波清洗器、鼓風(fēng)干燥箱、生化培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋。

1.4 培養(yǎng)基配方

PDA培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯 200 g（煮汁），葡萄糖20 g，瓊脂 15 g。胡蘿卜培養(yǎng)基（g/L）：胡蘿卜 200 g（煮汁），葡萄糖20 g，瓊脂 15 g。GPC培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，玉米漿10 g，瓊脂15 g。GPY培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，酵母膏10 g，瓊脂15 g。麥麩培養(yǎng)基（g/L）：麥麩30 g（煮汁過濾），葡萄糖20 g，瓊脂15 g。麥芽培養(yǎng)基（g/L）：麥芽粉50 g（煮汁過濾），瓊脂15 g。各培養(yǎng)基pH均自然。

1.5 培養(yǎng)方法

利用PDA培養(yǎng)基對(duì)菌種進(jìn)行活化，12天后用打孔器在長好菌絲的培養(yǎng)基上打孔，將每一塊菌種接至事先配好的鋪有滅菌玻璃紙的不同培養(yǎng)基正中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，各處理重復(fù)10次。定期觀察菌落形態(tài)變化、菌絲生長情況，并測(cè)定菌落直徑。

1.6 不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體干濕重測(cè)定

將接種于不同培養(yǎng)基的桑黃置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)7天、9天、11天、13天、15天，可在培養(yǎng)基表面形成一層可剝離的菌絲體，每次取每種培養(yǎng)基的3個(gè)平板進(jìn)行測(cè)量，揭下鋪在培養(yǎng)基上的玻璃紙，用鑷子將菌絲體仔細(xì)剝離后置于烘箱，60 ℃烘至恒重，測(cè)干重。

1.7 不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體黃酮含量測(cè)定

（1）樣品液的制備。將烘干后的所有不同培養(yǎng)基及不同培養(yǎng)時(shí)間的桑黃菌絲體置于50～55 ℃烘箱烘至八成干，取出剪成小碎塊，再于60 ℃下烘24 h后粉碎[13]。

樣品溶液：取研磨好的桑黃粉末1 g溶于 70%乙醇，定容至10 mL，超聲波（40 kHz）提取 2 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液備用[14]，以上各處理重復(fù)3次。

（2）紫外比色法。顯色液：取8.0 g硼酸和1.0 g乙酸鈉，加入乙醇溶解，定容至100 mL作為顯色液[14]。0.4 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用70%乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻備用[13]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL、120 μL和140 μL于試管中；加70%乙醇至5 mL，再加入5 mL顯色液混勻。加相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)波長385 nm處測(cè)定吸光度。在設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)液濃度梯度時(shí)注意：先設(shè)定一個(gè)范圍梯度，用空白對(duì)照溶液校零后，測(cè)定并記錄其吸光度值，而后測(cè)定樣品液的吸光度值，并對(duì)比梯度是否合適，若不合適，再根據(jù)樣品液重新設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)液濃度梯度。最后，以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取樣品0.5 mL于試管中，每個(gè)樣品3次重復(fù)；加70%乙醇至5 mL，再加入5 mL顯色液混勻；加相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，隨后放置在比色皿中，在波長385 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)制作的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算菌絲體中的黃酮含量。

2 結(jié)果分析

2.1 培養(yǎng)基與桑黃菌絲生長的關(guān)系

不同培養(yǎng)基上桑黃菌絲的生長速度差異顯著（表1）。在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長速度快，生長13天，菌落直徑即可達(dá)9 cm（長滿培養(yǎng)皿），而麥麩和胡蘿卜培養(yǎng)基的菌絲生長速度居次，需15天；在GPC、GPY和麥芽培養(yǎng)基上生長較為緩慢。由表1還可看出，7～11天菌落直徑差異最大，是桑黃菌絲生長最快的階段。

表1 6種培養(yǎng)基上桑黃菌落直徑變化和菌絲不同生長時(shí)期的黃酮含量

2.2 不同培養(yǎng)基的菌絲體含水量變化

如圖1可知，胡蘿卜、麥芽及麥麩3個(gè)培養(yǎng)基的菌絲體含水量較高。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，每種培養(yǎng)基上的菌絲體含水量都有不同程度的下降。培養(yǎng)第7天，接種在麥芽、麥麩和胡蘿卜培養(yǎng)基上的菌絲體含水量分別為89%、87%和86%，而在GPC培養(yǎng)基上生長的菌絲體含水量較低，僅76%。培養(yǎng)第9天，PDA和麥芽培養(yǎng)基上的菌絲體含水量顯著下降，其次是GPC，而GPY、胡蘿卜和麥麩3個(gè)培養(yǎng)基上的菌絲體含水量則變化不大。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基的桑黃菌絲體含水量

總體看，培養(yǎng)7～11天，菌絲體含水量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低。原因可能是發(fā)菌培養(yǎng)第7～11天是桑黃菌絲體快速生長期，期間需要消耗大量水分，轉(zhuǎn)運(yùn)或溶解基質(zhì)中的養(yǎng)分，從而轉(zhuǎn)化為自身物質(zhì)，致使含水量明顯下降。

2.3 不同培養(yǎng)基的菌絲體生物量

由圖2可知，發(fā)菌培養(yǎng)15天，以GPY培養(yǎng)基上的菌絲體干重最大，達(dá)到0.3659 g，遠(yuǎn)超其他5種培養(yǎng)基；麥芽培養(yǎng)基的菌絲體干重最小，胡蘿卜培養(yǎng)基也較小；其他3種培養(yǎng)基的干重基本持平。選擇第15天進(jìn)行分析，是因?yàn)樵谏L后期桑黃菌落大，培養(yǎng)時(shí)間長，各培養(yǎng)基上的菌絲體對(duì)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)利用已經(jīng)比較充分并積累了一定的養(yǎng)分，有利于進(jìn)行比較。菌絲體干重越大，說明該培養(yǎng)基所提供的養(yǎng)分或元素越適宜桑黃菌絲的吸收和生長。

圖2 培養(yǎng)15天時(shí)不同培養(yǎng)基上菌絲體的干重

2.4 不同培養(yǎng)基上不同時(shí)間段的菌絲體黃酮含量

通過蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=3.8155x-0.0051（R2=0.9977），測(cè)定分析不同培養(yǎng)基上的桑黃菌絲體在不同生長時(shí)期的黃酮含量差異。結(jié)果表明，在不同的生長時(shí)間，不同培養(yǎng)基上的菌絲體黃酮含量差異顯著（表1）。各培養(yǎng)基的菌絲體黃酮含量總體上都隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加。其中以GPY和麥麩培養(yǎng)基上的黃酮含量整體表現(xiàn)較高，且隨時(shí)間的延長，含量增加較平穩(wěn)。培養(yǎng)前期，胡蘿卜培養(yǎng)基上的黃酮含量非常低，麥芽培養(yǎng)基上幾近為零；但在第13天后胡蘿卜、PDA和麥芽培養(yǎng)基上的黃酮含量均有不同幅度的增加，其中以胡蘿卜培養(yǎng)基的變化較為顯著。培養(yǎng)至第15天，胡蘿卜培養(yǎng)基上的菌絲體黃酮含量增加顯著，躍居第一，為0.91%。究其原因，可能是在第13天時(shí)菌絲已長滿培養(yǎng)皿，之后因生長環(huán)境局限（即養(yǎng)分不足）而刺激了次級(jí)代謝，導(dǎo)致黃酮含量的劇增[15]。

在供試的6種培養(yǎng)基上，菌絲生長初期普遍含一定量黃酮，這可能是由于接種使用的原菌種塊含有黃酮所致，其對(duì)生長初期較小的新生菌落中的黃酮含量測(cè)定結(jié)果影響較大。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過測(cè)定分析桑黃菌絲在6種基本培養(yǎng)基培養(yǎng)7天、9天、11天、13天、15天的菌絲體黃酮含量、生長速度、含水量及干重，得出：桑黃菌絲在PDA和胡蘿卜培養(yǎng)基上生長速度快，而在GPC和GPY培養(yǎng)基上生長緩慢；菌絲干重，以GPY培養(yǎng)基最大麥芽培養(yǎng)基最小；菌絲體黃酮含量前期以GPY和麥麩培養(yǎng)基較高，培養(yǎng)后期以胡蘿卜培養(yǎng)基為高，以麥芽培養(yǎng)基最低。6種培養(yǎng)基的菌絲含水量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低；菌絲體中的黃酮含量則隨時(shí)間的延長而增加。

采用固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)桑黃菌絲，從黃酮含量看，GPY和胡蘿卜培養(yǎng)基是較優(yōu)的培養(yǎng)基；麥麩培養(yǎng)基上的黃酮含量也高，且成本較GPY培養(yǎng)基低得多，性價(jià)比最高。