天麻蛋白制備抗銅綠假單胞菌多肽最佳胃蛋白酶水解條件?

陳行書, 劉偉朋, 薛慧星, 童 雨, 王華林, 張孝林

(安徽科技學院生命與健康科學學院, 安徽 鳳陽 233100)

天麻(Gastrodiaelata Blume)是蘭科天麻屬, 其球莖依靠從寄生的蜜環菌的菌絲獲取營養的多年生草本植物, 然而, 天麻的球莖被密環菌侵染和寄生確沒有被真菌感染, 證明天麻中含有抗真菌成分。 后來人們研究發現天麻抗真菌活性成分是抗真菌蛋白[1]。 近期, 逯家輝等把抗菌蛋白在蛋白酶水解成為短肽, 發現具有更強的抗菌活性并可開發成抗菌凝膠[2]。 但蛋白酶水解蛋白受蛋白酶的種類和用量, 蛋白酶的水解溫度, 蛋白酶的水解時間, 蛋白酶水解酸堿度(pH)等因素的影響。 逯家輝等是利用木瓜蛋白酶、 胰酶、 風味蛋白酶對天麻蛋白進行水解獲得抗菌活性短肽, 不同蛋白酶水解氨基酸殘是不同的, 例如: 胰蛋白酶主要水解賴氨酸和精氨酸; 胃蛋白酶主要水解芳香族氨基酸的N 端或C 端[3]。 不同蛋白酶水解獲得的短肽具有不同的化學結構, 不同化學結構的短肽其有不同抗菌活性[4]。另外同一蛋白酶的不同水解條件獲得的抗菌活性多肽存在差異, 導致抗菌活性存在差異[5], 因此, 對蛋白酶水解條件進行優化獲得具有最強抗菌活性的最佳水解條件具有重要的科學價值。 胃蛋白酶是一種常見的蛋白酶, 國內外還鮮見其對天麻蛋白水解產物抗菌活性的報道。 本研究以胃蛋白酶水解從天麻中提取的天麻蛋白獲得短肽, 考察胃蛋白酶水解天麻蛋白獲得多肽是否具有更強的抗銅綠假單胞菌活性, 且多肽抗銅綠假單胞菌活性的最佳水解條件。 為天麻蛋白進一步的開發應用提供理論依據和技術方法。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

天麻: 采集于安徽亳州天麻種植戶。 菌種: 銅綠假單胞菌標準株ATCC9027 保存安徽科技學院生命與健康科學學院藥學系微生物學與免疫學實驗室; 酶及蛋白質定量試劑: 胃蛋白酶, Bradford 蛋白濃度測定試劑盒均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。 培養基: 營養肉湯和營養瓊脂, 北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀 器

FA21048 電子天平, 上海市精密科學儀器總廠;SpectraMax190 酶標儀, 美國MD 全波長酶標儀; 真空冷凍干燥機, 德國 Martin Christ 公司; 高速冷凍離心機, 美國 Thermo Fisher Scientific 公司; 酸堿 pH 計, 瑞士 Mettler Toledo 公司;LSHZ-300 恒溫水浴振蕩器, 太倉市華美生化儀器廠; MYP13-2S 磁力攪拌器, 上海梅穎浦公司; 恒溫培養箱, 合肥右科設備有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 天麻蛋白的制備

天麻的鮮球莖用水洗凈除去泥沙, 切成小塊或薄片, 按料液比1∶8(g/mL)加入4 ℃預冷的生理鹽水, 用絞肉機勻漿10 ~15 min 至漿糊狀, 勻漿物用4 層紗布減壓過濾, 收集濾液, 在冷凍離心機4 ℃ 5000 r/min 離心10 min, 用加樣槍小心取上清液, 用量筒量測量體積, 把盛上清液的燒杯置于磁力攪拌器上攪拌, 邊攪拌便加入硫酸銨, 最終加入硫酸銨的量達到70%(g/mL)飽和狀態, 放置4 ℃冰箱(或冰浴)靜置1 h 后,4 ℃5000 r/min 離心10 min 棄上清液, 沉淀物用生理鹽水溶解, 加入透析袋中, 透析2 次除去硫酸銨, 把透析袋中的蛋白溶解在適量的PBS(pH=6)。 用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度(按照試劑盒說明書的操作方法進行), 最終把蛋白質濃度調至2 mg/mL 后4 ℃貯存備用(不要超過3 天, 超過 3 天-20 ℃貯存)。

1.3.2 胃蛋白酶水解天麻蛋白

取1 mL 濃度為2 mg/mL 的天麻蛋白(pH=6)于2 mL 的離心管中, 加入0.2 mg/mL 的蛋白酶(pH=6)1 mL, 在37 ℃震蕩水浴3 h 后, 在80 ℃溫浴30 min 滅活蛋白酶。 檢測胃蛋白酶水解天麻蛋白產物抗銅綠假單胞菌抗菌活性。

1.3.3 天麻蛋白與酶水解天麻蛋白產物多肽抗銅綠假單胞菌活性比較

牛津杯法檢測抗菌活性: 將已滅菌的營養瓊脂培養基(瓊脂培養基的配制方法: 33.0 g 瓊脂培養基加入1000 mL 蒸餾水中, 煮沸溶解, 121 ℃滅菌15 min)趁熱把15 mL 瓊脂培養基倒入直徑為9 cm 的滅菌培養皿中。 待瓊脂培養基凝固后, 取用肉湯培養基培養(肉湯培養基的配制方法: 18 g 肉湯培養基溶解在1000 mL 蒸餾水中, 115 ℃滅菌30 min)OD600的吸光度值為0.1 對數生長期的銅綠假單胞菌50 μL 均勻涂布在固體培養基上。 在上面均勻放置牛津杯9 個, 3 個里面加入天麻蛋白溶液25 μL+蒸餾水25 μL, 3 個里面加入天麻蛋白酶水解多肽液50 μL(含天麻蛋白溶液25 μL+胃蛋白酶25 μL), 3 個里面加入胃蛋白酶25 μL+蒸餾水 25 μL。 在恒溫培養箱中 37 ℃培養18 ~24 h。 用游標卡尺測抑菌圈的大小, 每個抑菌圈從不同方向測3 次求平均值。

1.3.4 單因素條件的確立

酶對蛋白水解影響的主要因素是水解溫度、 水解時間和pH 值。 本研究以抑菌圈大小為指標, 首先對上述三單因素進行考察, 在獲得最佳單因素條件后, 設計正交實驗, 確立天麻蛋白水解物具最強抗銅綠假單胞菌的水解條件。

1.3.5 天麻蛋白酶水解產物多肽對銅綠假單胞菌抗菌活性的單因素考察

1.3.5.1 蛋白酶水解溫度對水解產物多肽抗菌活性的影響

取5 支2 mL 的離心管, 分別加入1 mL 濃度為2 mg/mL 的天麻蛋白(pH=6)和0.2 mg/mL 的蛋白酶(pH=6)1 mL, 在17 ℃、 27 ℃、 37 ℃、 47 ℃、 57 ℃震蕩水浴 3 h 后, 在 80 ℃溫浴30 min 滅活蛋白酶。 檢測水解產物多肽抗銅綠假單胞菌抗菌活性, 每個實驗做三次求平均值。

1.3.5.2 蛋白酶水解時間對水解多肽產物抗菌活性的影響

取5 支2 mL 的離心管, 分別加入1 mL 濃度為2 mg/mL 的天麻蛋白(pH=6)和0.2 mg/mL 的蛋白酶(pH=6)1 mL, 在37 ℃震蕩水浴 1 h、 2 h、 3 h、 4 h、 5 h 后, 在 80 ℃ 溫浴30 min 滅活蛋白酶。 檢測水解產物多肽抗銅綠假單胞菌抗菌活性, 每個實驗做三次求平均值。

1.3.5.3 蛋白酶水解pH 對水解產物多肽抗菌活性的影響

取5 支2 mL 的離心管, 分別加入1 mL 濃度為2 mg/mL 的天麻蛋白(pH=3、 pH=4、 pH=5、 pH=6、 pH=7)和 0.2 mg/mL的蛋白酶(pH=3、 pH=4、 pH=5、 pH=6、 pH=7)1 mL, 在37 ℃震蕩水浴3 h 后, 在80 ℃溫浴30 min 滅活蛋白酶。 檢測水解產物多肽抗銅綠假單胞菌抗菌活性, 每個實驗做三次求平均值。

1.3.6 正交實驗設計

以1.3.5 單因素實驗結果為依據, 選取水解產物多肽具有較強抗銅綠假單胞菌活性的蛋白酶水解條件的3 因素水平, 進一步設計3 因素3 水平正交試驗, 通過試驗獲得天麻蛋白水解產物多肽最強抗銅綠假單胞菌活性水解工藝條件。 因素水平如表1 所示, 正交試驗結果如表2 所示。

2 結果與討論

2.1 天麻蛋白與水解產物抗菌活性比較

根據1.3.2 和1.3.3 的試驗, 天麻蛋白和天麻蛋白經蛋白酶對天麻蛋白水解的產物多肽對銅綠假單胞菌的抑菌圈大小分別為6.32 mm 和16.15 mm(牛津杯的直徑約6 mm), 胃蛋白酶對銅綠假單胞菌沒有抑菌活性, 沒有抑菌圈產生。 試驗結果說明: 天麻蛋白對銅綠假單胞菌抑菌活性很小。 但天麻蛋白經胃蛋白酶水解成多肽后其抗銅綠假單胞菌活性明顯增強。 因此,可以進一步進行天麻蛋白經胃蛋白酶水解產物抗銅綠假單胞菌最佳水解工藝研究。

2.2 單因素試驗的結果

2.2.1 酶水解溫度對水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性的影響

溫度對胃蛋白酶水解天麻蛋白的產物多肽抗銅綠假單胞菌活性的影響如圖1 所示。 酶解溫度從17 ℃到37 ℃時隨著水解溫度的升高水解產物多肽對銅綠假單胞菌的抗菌活性逐漸增強, 當酶水解溫度從37 ℃到57 ℃時, 水解產物多肽對銅綠假單胞菌的抗菌活性沒有增強反而有所減小。 原因可能是胃蛋白酶水解蛋白的最佳溫度是37 ℃左右, 隨著溫度的不斷升胃蛋白酶活性逐漸失活, 水解天麻蛋白活性逐漸降低。 因此, 天麻蛋白水解產物多肽具有較好抗幽門螺桿菌活性的水解溫度為37 ℃。

圖1 溫度對天麻蛋白水解產物多肽抗菌活性的影響Fig.1 Effect of temperature on antimicrobial activity of peptides from Gastrodiaelata protein hydrolysate

2.2.2 酶水解時間對水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性的影響

時間對胃蛋白酶水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性的影響如圖2 所示。 酶水解時間從1 h 到3 h 時隨著胃蛋白酶水解時間的延長水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性逐漸增強, 當水解時間從3 h 至4 h 時, 天麻蛋白水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性, 沒有明顯變化。 但從4 h 至5 h 時, 天麻蛋白水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性, 沒有增強反而有所減小, 可能蛋白酶在水解3 h 至4 h 時水解天麻蛋白獲得的多肽成分具有強的抗銅綠假單胞菌活性, 4 h 后隨著水解時間的延長, 其最強抗菌成分多肽被蛋白酶非特異性降解破壞成無活性的水解產物。因此, 天麻蛋白水解產物多肽具有較好抗幽門螺桿菌活性的水解時間為3 h。

圖2 時間對天麻蛋白水解產物多肽抗菌活性的影響Fig.2 Effect of time on antimicrobial activity of peptides from Gastrodiaelata protein hydrolysate

2.2.3 酶水解pH 對水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性的影響

pH 對胃蛋白酶水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性的影響如圖3 所示。 pH 從1 到1.5 時胃蛋白酶水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性逐漸增強, pH 從1.5 到2 時胃蛋白酶水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性抗菌活性增加不明顯, 當pH 值大于2 后,天麻蛋白水解產物多肽的抗菌活性并沒有增強反而有所減小,可能與胃蛋白酶水解的最適pH 是1.5 ~2.0 有關, 當水解pH=2 時胃蛋白酶對天麻蛋白的酶解活性最強。 因此, 天麻蛋白水解產物多肽具有較好抗幽門螺桿菌活性的水解pH 是2。

圖3 pH 對天麻蛋白水解產物多肽抗菌活性的影響Fig.3 Effect of pH on antimicrobial activity of peptides from Gastrodiaelata protein hydrolysate

2.3 正交試驗設計與結果

2.3.1 正交試驗因素和水平確立

根據單因素獲得抑制尿素酶活性的浸提因素的浸提條件,設計下列正交試驗各因素水平如表1 所示。

表1 正交試驗各因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2.3.2 正交試驗結果

按照1.3.3 試驗方法測得天麻蛋白胃蛋白酶水解產物多肽對銅綠假單胞菌抑菌圈的大小, 根據單因素試驗結果確立的3因素和3 水平進行正交試驗(表1), 測得水解產物多肽對銅綠假單胞菌的抑制圈正交試驗結果如表2 所示。 從表2 正交試驗結果可以看出: 三個因素的極差R 可知3 因素中A 因素溫度對水解產物多肽抑菌活性影響最大, 水解時間B 因素對水解產物多肽抑菌活性影響最小, 其次C 因素酸堿度pH 對水解產物多肽抑菌活性影響較大。 天麻蛋白被胃蛋白酶水解產物多肽對銅綠假單胞菌具最強抑制活性的組合是A2B3C3, 即酶水解溫度37 ℃, 酶水解時間為4 h 及酶水解酸堿度pH 為2.5 的水解條件獲得的天麻水解產物多肽抗銅綠假單胞菌的活性的活性最強。 但水解最佳組合條件A2B3C3不存在于正交試驗表中, 因此, 需進一步做驗證試驗, 以A2B3C3酶水解條件進行3 次水解產物多肽銅綠假單胞菌抑菌活性試驗抑菌圈大小為17.25 mm大于正交試驗表中的最大抑菌圈16.67 mm, 說明正交試驗獲得的最佳條件組合是正確的。

表2 水解產物多肽抗菌活性(抑菌圈)正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal test of antibacterial activity(inhibition zone) for hydrolysate peptides

3 結 論

文獻報道: 天麻具有多種藥理作用, 具有益智作用、 腦保護作用、 鎮痛作用、 鎮靜催眠作用、 抗癲癇作用、 抗暈眩作用、 降壓作用、 降血脂作用、 抗氧化作用、 保肝作用、 抗腫瘤作用、 增強免疫力作用等[6]。 天麻中含有多種化學成分其中含有抗真菌蛋白成分[7]。 并且科研工作者對抗真菌蛋白進行了深入研究[8-11]。 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種引起人類機會性感染的普遍存在的革蘭陰性細菌, 并且在臨床出現抗生素抵抗菌株[12]。 這給臨床治療帶來困難和挑戰。 必須尋求新的抗菌物質, 其中抗菌活性的多肽就是一種值得研究的候選物。 因其抗菌機制不同于抗生素主要通過破壞細菌細胞膜結構完整性, 增加細胞膜滲透性達到殺菌作用, 細菌不易產生耐藥性[13]。 本研究證實: 天麻蛋白經胃蛋白酶水解后的產物多肽具有抗銅綠假單胞菌活性。 但天麻蛋白水解產物多肽抗銅綠假單胞菌活性受水解時間、 水解溫度和水解液的酸堿度pH 等因素的影響。 其最佳抗菌活性的水解條件是酶水解溫度37 ℃, 酶水解時間為4 h 及酶水解酸堿度pH 為2.5。 本研究證實利用酶法水解蛋白可以獲得具有抗菌活性的多肽, 為將來水解蛋白可以獲得具有抗菌活性多肽途徑及天麻蛋白的進一步開發利用提供理論依據和技術方法。 但天麻蛋白胃蛋白酶水解產物抗菌活性的多肽的結構和其抗銅綠假單胞菌的抗菌機制有待進一步研究。