星毛冠蓋藤乙酸乙酯部位抗三陰乳腺癌的研究?

石雅倩, 耿夢麗, 李紅娜, 黃思源, 李麗霞, 黃 怡, 鐘一真, 歐葉濤

(1 桂林醫學院基礎醫學院, 廣西 桂林 541004; 2 新鄉醫學院三全學院基礎醫學院, 河南 新鄉 453003)

三陰乳腺癌是一種雌激素(ER)、 孕激素(PR)以及人表皮生長因子受體2(HER-2)表達均呈陰性的乳腺癌的特殊亞型,具有高侵襲性、 高轉移潛能、 易復發、 預后差的特點, 一直是乳腺癌臨床治療中的重點和難點, 目前仍十分缺乏有效的治療手段和藥物[1]。 天然植物抗腫瘤具有靶點多樣、 毒副作用小的明顯優勢[2]。 星毛冠蓋藤(Pileostegia Tomentella Hand. -Mazz.), 又名腫瘤藤、 消瘤藤[3], 是一味傳統的瑤族常用中草藥, 具有顯著的抗癌作用, 而目前十分缺乏對其藥理機制的報道。 本研究探討星毛冠蓋藤乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Pileostegia tomentella, PTE)對三陰乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響, 以細胞MDA-MB-231 為研究對象, 運用MTT 方法檢測并計算PTE 抑制細胞增殖的最佳作用時間和IC50, 選取合適的時間和劑量處理細胞后, 臺盼藍染色法明確PTE 的殺傷作用, TUNEL 方法檢測細胞凋亡情況, Western blot 檢測細胞內凋亡相關蛋白的表達情況。 綜合評價PTE 的抗三陰乳腺癌效果, 為星毛冠蓋藤的開發利用提供理論依據, 促進民族醫藥的發展。

1 實 驗

1.1 材 料

(1)試驗藥物: 星毛冠蓋藤采于廣西金秀地區(金秀縣羅香鄉白牛村, 北緯23.958411 度, 東經110.225487 度, 定位 K 碼8vqs4kdch, 海拔高度547 米), 經廣西壯族自治區中國科學院植物研究所黃俞淞研究員鑒定為藥用星毛冠蓋藤全草。

(2)人三陰乳腺癌MDA-MB-231 細胞, 美國 ATCC 細胞庫; 四氮唑藍(MTT)、 臺盼藍染液, 碧云天生物技術公司;TUNEL 試劑盒, 江蘇凱基生物技術股份有限公司; Caspase-3抗體, CST 公司; 環磷酰胺, MCE 公司; 真空冷凍干燥機, 寧波新芝生物科技股份有限公司; 旋轉蒸發儀, 德國IKA 公司;多功能酶標儀, TECAN 公司; 正置、 倒置熒光顯微鏡, 德國徠卡有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 藥物提取

取星毛冠蓋藤的藤莖, 陰干后粉碎, 過50 目篩, 取藥材粉末300 g, 分別用75%、 85%、 95%、 95%、 95%乙醇各超聲提取一次, 液料比(mL/g)8∶1, 40 kHz, 40 min/次。 0.22 μm微孔濾膜過濾, 合并濾液, 濃縮得總提物, 留樣后用水混懸,乙酸乙酯(分析純)萃取, 合并濾液后濃縮得乙酸乙酯部位提取物(PTE), 冷凍干燥機凍干后, 4 ℃保存備用。

1.2.2 四氮唑藍(MTT)比色實驗

細胞增殖率檢測: 乳腺癌細胞MDA-MB-231 以3×103/孔接種于96 孔板中, 不同劑量的PTE 處理細胞, 2.8 mg/mL 的環磷酰胺處理為陽性對照, 陰性對照組不加藥, 空白組只加培養液(不種細胞), 每組6 個重復孔。 繼續培養24 h、 48 h、 72 h后加MTT, 孵育箱內避光培養4 h 后, 多功能酶標儀檢測各組在490 nm 處的吸光度, 計算細胞增殖活性。 藥物對細胞的抑制率=1-(實驗-空白)/(陰性-空白)×100%。

1.2.3 臺盼藍染色實驗

細胞死亡率檢測: MDA-MB-231 細胞PTE 處理后48 h 收集細胞, 調整至適當濃度, 臺盼藍染色3 min, 細胞計數板上觀察, 拍照、 計數、 計算細胞死亡率。 細胞死亡率=死細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 TUNEL 法檢測細胞凋亡

乳腺癌細胞MDA-MB-231 以2×104/孔接種于24 孔板細胞爬片上(多聚賴氨酸包被), PTE 處理后 48 h 檢測。 根據TUNEL 試劑說明書處理樣本, 固定、 通透、 TdT 酶標記、Streptavidin-Fluorescein 標記、 DAPI 復染、 封片觀察。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達

乳腺癌細胞MDA-MB-231 以90×104/皿接種于10cm 滅菌培養皿中, 次日加藥PTE 500 μg/mL, 48 h 后提取總蛋白。 運用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白; 200 mA, 1.5 h 轉膜至0.22 μm 的PVDF 膜上, 5%脫脂奶粉封閉, 一抗(1∶1000)孵育過夜(4 ℃, 約16 h); 次日回收抗體, 二抗(1∶10000)孵育1 h, 洗膜成像。

1.3 統計學分析

采用SPSS 25.0 統計分析軟件處理數據, 不同劑量給藥組間抑瘤率比較采用單因素方差分析, 兩組間比較用獨立樣本t檢驗, 當p<0.05 時差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 藥物提取

300 g 藥材粉末, 超聲乙醇提取, 濃縮后得總提物22 g; 乙酸乙酯萃取, 濃縮后得乙酸乙酯提取物5.4 g。

2.2 PTE 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞增殖的影響

MTT 結果顯示, 經PTE 處理后24 h, 細胞增殖活性有一定降低; 加藥后48 h, 細胞密度明顯下降, 形態明顯異常, 增殖活性降低, 且呈明顯的劑量依賴性; 加藥后72 h, 細胞增殖依然被抑制, 但與加藥后48 h 的抑制效果差異不大(見圖1、圖2)。 由此表明: PTE 對MDA-MB-231 具有明顯的抑增殖作用, 48 h 時抑制作用已接近平臺期, 此時的IC50為503.4060±4.9686 μg/mL。 因此, 本實驗選取 500 μg/mL、 48 h 為處理條件, 繼續下一步的研究(詳細IC50見表1)。

圖1 PTE 對MDA-MB-231 增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of PTE on proliferation of MDA-MB-231

圖2 細胞形態學觀察Fig.2 Cell morphology

表1 星毛冠蓋藤乙酸乙酯提取物對乳腺癌細胞的IC50Table 1 IC50 of ethyl acetate extract of Pileostegia tomentella on breast cancer cells

2.3 PTE 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞的殺傷效果

PTE 500 μg/mL 處理細胞, 48 h 后進行臺盼藍染色。 結果顯示: 每個樣本, 即4 個計數大格細胞總數約600 ~800 個, 其中陰性組死細胞約40 ~50 個, PTE 組死細胞約300 ~350 個,陰性組死亡率3.87%, PTE 組細胞死亡率42.99%(見圖3),提示PTE 對乳腺癌細胞具有明顯的殺傷作用。

圖3 臺盼藍染色結果Fig.3 Results of Trypan blue staining

2.4 PTE 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞凋亡的影響

PTE 500 μg/mL 處理細胞, 以2.8 mg/mL 的環磷酰胺處理做陽性對照, 陰性對照組不做任何處理, 48 h 后進行TUNEL染色。 結果顯示, 陰性對照組未出現綠色熒光, PTE 組和環磷酰胺組檢測到明顯綠色熒光顆粒。 結果提示: PTE 可以誘導乳腺癌細胞發生凋亡(見圖4)。

圖4 TUNEL 染色結果Fig.4 Results of TUNEL

2.5 PTE 對乳腺癌MDA-MB-231 細胞中Caspapse-3 表達的影響

PTE 500 μg/mL 處理細胞, 48 h 后提蛋白檢測。 結果顯示,PTE 顯著激活了Caspase-3(見圖5), 這表明Caspase-3 參與了PTE 誘導MDA-MB-231 細胞凋亡的過程。

圖5 Western blot 檢測 MDA-MB-231 加藥 48 h 后Caspase-3 的表達情況Fig.5 MDA-MB-231 Cells were treated withPTE (500 μg/mL)for 48 h, the expressions of Pro-Casp-3were deteted by Western blot

3 結 論

星毛冠蓋藤, 是虎耳草科冠蓋藤屬植物[4], 主要化學成分包括黃酮類、 苷類、 香豆素類、 萜類、 芳香類等[5], 具有抗氧化、 抗腫瘤的生物活性[6]。 目前, 關于星毛冠蓋藤的研究僅有少數幾篇文獻報道, 且大多集中于化學成分的研究以及提取技術的優化, 缺乏對其抗腫瘤藥理的報道。 此外, 由于三陰乳腺癌中缺乏ER、 PR、 HER-2 的表達, 其對內分泌治療和HER-2靶向治療并不敏感, 目前十分缺乏科學有效的治療手段。 因此, 本研究選取三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231 作為研究對象,探究星毛冠蓋藤乙酸乙酯部位對其增殖及凋亡的影響。

MTT 比色法是常用的細胞活性檢測技術, 一般用于大規模的抗腫瘤藥物篩選[7], 但其只能反映細胞的存活狀態, 無法鑒別細胞的增殖抑制與死亡。 因此, 本研究運用MTT 與經典的臺盼藍染色技術相結合的方法[8], 對PTE 的作用進行雙向驗證,結果發現: PTE 對三陰乳腺癌MDA-MB-231 細胞的增殖活性具有顯著的劑量依賴性抑制作用。 明場顯微鏡下觀察可見: 與陰性組相比, 藥物處理后的細胞密度明顯下降, 形態不再是平滑的梭形, 而呈異常的球形, 明顯皺縮, 細胞間連接減少。 同時, 臺盼藍結果顯示, 加藥后的細胞死亡率顯著增高。 由此可見, PTE 對MDA-MB-231 細胞具有抑增殖、 促死亡的雙重作用。 與我們的研究結果一致, 王云卿[9]、 謝金攀[10]等人報道,星毛冠蓋藤總提取物和石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇等部位萃提物可有效抑制肝癌、 宮頸癌細胞的增殖活性, 都肯定了星毛冠蓋藤的抗癌效果。

凋亡是細胞程序性死亡的主要方式, 與腫瘤的發生發展密切相關[11]。 本實驗對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231 進行了凋亡相關的研究。 運用TUNEL 染色法對加藥后的細胞樣本進行了檢測, 結果發現: PTE 組樣本中可見明亮的綠色熒光顆粒,提示細胞發生了凋亡。 同時, PTE 加藥后48 h, Caspase-3 前體表達降低, 提示PTE 可以導致MDA-MB-231 細胞中Caspase-3的激活。 由此可見, PTE 能顯著抑制三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231 的增殖活性并誘導其發生凋亡, 其生理機制與Caspase-3的激活有關。 Caspase-3 是細胞凋亡的執行蛋白, 在藥物誘導乳腺癌細胞發生凋亡的過程中發揮著至關重要的作用[12], 有研究表明, 星毛冠蓋藤乙酸乙酯萃取物可以通過介導ROS 的產生來誘導肺癌細胞H1299 發生Caspase 依賴的凋亡, 從而發揮抗癌作用[13]; 總香豆素部位可以顯著抑制結腸癌細胞HT-29 的增殖、 克隆、 遷移和侵襲能力, 還能顯著下調細胞中Bcl-2 和NF-κB 的蛋白表達, 激活 Caspase-3 , 促進細胞凋亡[14]。 這提示我們, 在PTE 激活Caspase-3, 誘導乳腺癌細胞凋亡的過程中, 可能會有 ROS、 Bcl-2、 NF-κB 以及 Caspase-3 等分子的參與, 具體的分子生物學機制尚需進一步的深入探討。