外周血CKLF1、CCR4與高血壓腦出血后血腦屏障破壞及預后的關系

于大君，董春玉，于永鵬

腦出血為神經外科常見疾病，是指非外傷性腦實質內血管破裂而引起的出血，具有發病急、致殘率與致死率高、預后差的特點，高血壓腦出血屬于高血壓嚴重的并發癥，多發于中老年人，且發病率有升高趨勢[1-2]。因此，尋找反映腦出血病人病情嚴重程度和預后的標志物對于其預防和治療具有重要意義。腦出血引起的腦損傷是一個復雜的過程，研究表明，一些細胞因子和炎癥反應在腦損傷中發揮重要作用，趨化素樣因子1(chemokine-like factor 1，CKLF1)屬于趨化素樣超家族，具有趨化因子的結構特征和功能，在炎癥性疾病中發揮一定作用[3]。羅澤兵等[4]研究表明，重癥顱腦損傷術后腦梗死病人血清CKLF1水平升高，且隨著病情加重，血清CKLF1水平升高，并與病人預后有關。趨化因子受體(chemokine receptor，CR)屬G蛋白偶聯受體，CC趨化因子受體4(CCR4)為CC趨化因子受體(CCR)的一種，能促進白細胞浸潤及細胞增殖，也是CKLF1的受體[5]。研究表明，在腦缺血損傷模型中，香豆素類衍生物IMM-H004可下調CKLF1與CCR4表達，抑制NOD樣受體家族3(nucleotide binding oligomerization domain，NLRP3)炎癥小體激活及相關炎癥反應，改善腦缺血程度[6]。目前CKLF1、CCR4在高血壓腦出血病人中的研究報道不多。本研究通過檢測高血壓腦出血病人外周血CKLF1、CCR4表達情況，并探討其與腦出血后血腦屏障破壞的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年5月—2020年6月就診的高血壓腦出血病人85例作為腦出血組，其中，男55例，女30例；年齡42～74(58.30±8.70)歲。納入標準：①符合2015年腦出血的診斷標準[7]，并經CT或磁共振成像(MRI)診斷為腦出血；②發病至入院時間<12 h；③有高血壓病史；④病人或家屬知情同意。排除標準：①顱內動脈瘤破裂出血、腫瘤、創傷等其他因素引起的腦出血；②既往有血液系統疾病，如血小板計數減少、彌漫性血管內凝血等；③嚴重腦、心、肝、腎等臟器器質性病變或功能障礙者；④臨床資料不全者。病人入院后進行開顱血腫清除術，術后給予止血、降低顱內壓、預防感染等常規治療，術后2周根據格拉斯哥預后量表(GOS)評分將病人分為預后良好組(GOS評分4分或5分，54例)和預后不良組(GOS評分1～3分，31例)。另選取同期健康體檢者85名作為對照組，其中，男60名，女25名；年齡41～73(57.90±8.40)歲。腦出血組與對照組性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，病人或家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 白蛋白檢測試劑盒購于美國 Sigma 公司，CKLF1、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、血清 S100鈣結合蛋白B(S100B)檢測試劑盒購自美國R & D公司，熒光標記的小鼠抗人FITC-CD4、PE-CCR4及FITC-IgG1、PE-IgG1抗體購自美國R&D公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 采集腦出血病人與健康體檢者清晨空腹靜脈血各5 mL，取其中一部分，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，離心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)，用于檢測CCR4。其余在室溫條件下靜置30 min，常溫下1 500 r/min離心20 min后收集血清，于-80 ℃條件保存備用，用于CKLF1及其他生化指標檢測。

1.3.2 流式細胞儀檢測外周血CCR4水平 取分離的PBMCs，加細胞懸液100 μL至檢測管，加入FITC-CD4單克隆抗體及設置同型對照管和檢測管，室溫避光孵育30 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后加入破膜液100 μL，同時加入鼠抗人PE-CCR4單克隆抗體及小鼠FITC-IgG1、PE-IgG1抗體，避光溫育30 min，PBS洗滌2次后，加入多聚甲醛溶液上流式細胞儀檢測，以CD4+CCR4+百分數表示CCR4水平。

1.3.3 其他指標檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測CKLF1、CRP、IL-6、TNF-α、S100B及白蛋白水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 資料收集 收集研究對象的年齡、性別、舒張壓、收縮壓、美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分等臨床資料，并計算血腦屏障功能指數(blood-brain barrier，BBB指數)，BBB指數=腦脊液白蛋白/血清白蛋白。

2 結 果

2.1 腦出血組與對照組臨床資料比較 與對照組比較，腦出血組舒張壓、收縮壓、CRP、TNF-α、IL-6、S100B水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 腦出血組與對照組臨床資料比較

2.2 腦出血組與對照組外周血CKLF1、CCR4水平比較 與對照組比較，腦出血組外周血CKLF1、CCR4水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 腦出血組與對照組外周血CKLF1、CCR4水平比較 (±s)

2.3 高血壓腦出血病人外周血CKLF1、CCR4水平與BBB指數、NIHSS評分的相關性 相關性分析顯示，高血壓腦出血病人外周血CKLF1水平與BBB指數、NIHSS評分呈正相關(r值分別為0.576，0.542；P均<0.05)，CCR4水平與BBB指數、NIHSS評分呈正相關(r值分別為0.543，0.519；P均<0.05)。詳見圖1。

圖1 CKLF1、CCR4水平與BBB指數、NIHSS評分的相關性(A為CKLF1與BBB指數的相關性；B為CKLF1與NIHSS評分的相關性；C為CCR4與BBB指數的相關性；D為CCR4與NIHSS評分的相關性)

2.4 不同預后高血壓腦出血病人外周血CKLF1、CCR4水平比較 與預后良好組比較，預后不良組外周血CKLF1、CCR4水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 不同預后高血壓腦出血病人外周血CKLF1、CCR4水平比較 (±s)

2.5 高血壓腦出血病人預后不良的影響因素 以腦出血病人預后不良為因變量，將CKLF1、CCR4水平作為自變量，Logistic回歸分析結果顯示，CKLF1、CCR4水平均是影響高血壓腦出血病人預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。詳見表4。

表4 高血壓腦出血病人預后不良的影響因素

3 討 論

高血壓腦出血是高血壓最嚴重的并發癥之一，病人以頭痛劇烈、惡心嘔吐、肢體麻木等為主要臨床表現，伴有躁動、嗜睡或昏迷等癥狀，嚴重者可導致顱內壓升高、呼吸衰竭、腦疝等，該病起病急、預后差，因此，早期診斷疾病、評估病情對改善預后具有重要意義[8-9]。

趨化因子能調節和控制細胞向炎癥組織的定向遷移、誘導細胞分化，CKLF1是一種人類趨化因子，是CCR4的功能性配體，對單核細胞、中性粒細胞和淋巴細胞具有趨化作用，參與多種炎癥和自身免疫性疾病的病理過程[10]。研究表明，局灶性腦缺血后CKLF1表達升高，抑制CKLF1活性可減輕中性粒細胞浸潤和神經元凋亡，對腦缺血具有神經保護作用，CKLF1還可參與再灌注后血腦屏障的破壞，抑制CKLF1可以維持血腦屏障的完整性，從而避免腦缺血癥狀[11]。Tao等[12]研究表明，風濕性關節炎和強直性脊柱炎病人滑膜中CKLF1水平明顯升高，且風濕性關節炎病人CKLF1水平與炎性因子水平呈正相關。本研究結果顯示，腦出血組外周血CKLF1水平較對照組明顯升高，提示腦出血病人存在炎癥反應。預后不良組外周血CKLF1水平較預后良好組明顯升高，提示CKLF1可能參與腦出血發生，與腦出血病人預后有關。

趨化因子受體屬G蛋白偶聯受體，CCR4為CCR的一種，能促進白細胞浸潤及細胞增生。Chen等[13]研究表明，缺血性腦卒中小鼠模型中，經CKLF1給藥后，CKLF1通過CCR4加重早期局灶性腦缺血損傷，并促進小膠質細胞/巨噬細胞向M1表型極化，并且腦缺血小鼠的促炎細胞因子表達升高，抗炎細胞因子表達降低。孫立華等[14]研究表明，慢性乙型肝炎病人外周血中輔助性T細胞17(Th17)表面CCR4水平明顯升高，且隨著病情加重，CCR4水平升高。本研究結果顯示，與對照組相比，腦出血組外周血中CCR4水平明顯升高，且預后不良組外周血CCR4水平高于預后良好組，提示外周血CCR4水平可能與腦出血病人疾病發展及預后有關。

有研究認為，腦出血可以導致神經細胞功能障礙、血腦屏障破壞等，從而引起大量炎性因子、細胞因子釋放，多種因子相互作用，進而加重腦損傷。CRP和TNF-α為常見的血清炎性因子，腦出血時血清CRP和TNF-α水平升高，TNF-α可進一步誘導IL-6等促炎因子合成和釋放，增強炎癥細胞的黏附作用，提高血腦屏障通透性[15]。S100B反映腦損傷的嚴重程度，對腦出血病人病情評估有一定價值[16]。本研究結果顯示，腦出血組血清CRP、TNF-α、IL-6、S100B水平較對照組升高，說明高血壓腦出血病人體內存在炎癥反應和腦損傷，而CKLF1、CCR4升高可與炎癥反應有關。相關性分析顯示，CKLF1、CCR4水平與BBB指數和NIHSS評分呈正相關，提示CKLF1、CCR4與腦出血病人血腦屏障破壞和神經損傷有關。進一步分析顯示，CKLF1、CCR4水平高是影響高血壓腦出血病人預后不良的獨立危險因素，提示CKLF1、CCR4可作為腦出血病人預后評估的標志物。

綜上所述，高血壓腦出血病人外周血中CKLF、CCR4高表達，且與腦出血病人血腦屏障破壞和預后相關，有可能作為腦出血后病情評估與預后評估的標志物，但其具體作用機制仍需進一步研究。