蛋白激酶C在瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏大鼠脊髓背角中的表達及意義

劉 超 王 芳 李繼峰 武 強 李志國 金黛麗 靳 菲

1 河南省鶴壁市人民醫(yī)院麻醉科 458000； 2 濟寧中西醫(yī)結合醫(yī)院呼吸消化內科

瑞芬太尼是一種短效的μ型阿片受體激動劑，在臨床中應用廣泛，尤其是急性、慢性疼痛的治療及全身麻醉的維持[1]。瑞芬太尼痛覺過敏(Remifentanil-induced hyperalgesia，RIH)是指應用瑞芬太尼所導致的機體對傷害性刺激的反應增強現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為痛閾降低、痛感增強或痛覺異常[2]。研究表明RIH的分子機制可能包括MOR表達水平的下調和功能改變、中樞N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)激活、脊髓膠質細胞的活化等多方面，但具體機制尚不明確[3-4]。蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)已被證實參與多種疼痛調節(jié)信號通路，在神經(jīng)損傷后脊髓PKC表達水平顯著增加，且抑制PKC表達后可抑制NMDA受體的磷酸化，延緩痛覺過敏的發(fā)生[5-6]，但目前關于PKC在RIH中是否存在異常表達及是否參與RIH的發(fā)生尚不夠明確。因此，本研究通過建立RIH切口痛模型并檢測PKC在RIH大鼠脊髓背角中的表達情況，分析PKC表達與RIH發(fā)生可能的相關性，以期為瑞芬太尼誘導痛覺過敏的機制研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 30只6周齡SD雄性大鼠，體重(200±15)g，均購自河南省實驗動物中心，動物檢疫許可證號SYXK(豫)-2017-0001。注射用鹽酸瑞芬太尼(宜昌人福藥業(yè)有限責任公司，國藥準字H20030198)；PKC抑制劑Go6983(MedChemExpress公司)；PKC兔抗大鼠多克隆一抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，兔抗大鼠NMDA受體NR1、NR2A及NR2B亞基一抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理:將30只大鼠隨機分為對照組、瑞芬太尼組(R組)、切口痛模型組(M組)、瑞芬太尼+切口痛模型組(RM組)和PKC抑制劑組(Inhibitor組)，每組6只。所有大鼠均經(jīng)七氟醚麻醉(3%誘導，1%保持)后，尾靜脈置管，R組、RM組及PKC抑制劑組以1.0μg/(kg·min)的速度靜脈輸注瑞芬太尼，對照組及M組輸注同體積的0.9%NaCl溶液；5min后對M組、RM組和PKC抑制劑組建立Brennan切口痛模型，PKC抑制劑組大鼠在切口造模完成后背部剃毛、皮膚消毒，在L4～5處穿刺將 Go6983(5μl)注射入脊髓鞘內。對照組和R組僅仰臥固定于手術臺相同時間。

Brennan切口痛建模方法[7]：在無菌的環(huán)境下，建立SD大鼠左后足切口痛模型。其操作步驟如下：(1)取大鼠仰臥位，側頭固定于手術臺上，充分暴露左后足并用碘伏消毒；(2)用已消毒的11號刀片從足跟0.5cm處縱向延伸切開足面皮膚，切口長度約1cm，切口深至淺層筋膜；(3)在保持肌肉起止完整、不傷及周圍神經(jīng)和血管的情況下，用眼科鑷分離足骨膜與跖屈肌。術后繼續(xù)輸注瑞芬太尼(或0.9%NaCl)，25min后停止輸注并撤下尾靜脈留置軟管，同時消毒處理。在大鼠蘇醒后置于室溫、干燥、安靜的環(huán)境中單只分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 痛覺行為學檢測:分別于建模前24h(T-1)以及造模后2h(T1)、6h(T2)、24h(T3)、48h(T4)測定大鼠的熱刺激縮足潛伏期(Paw withdrawal thermal latency，PWL)和機械刺激縮足閾值(Paw withdrawal mechanical threshold，PWT)，每次測定前大鼠置于測定環(huán)境中適應性活動10min。采用熱刺痛儀(XR-YLS-22A，Xmaze)測定大鼠PWL，von Frey纖維絲(美國stoelting)測定PWT，測定間隔時間均為10min，測量3次取平均值。其中，PWL以秒(s)記錄，PWT以克(g)記錄。

PWL測定操作：基礎溫度設定為50°C，記錄大鼠從左后足接觸熱板至出現(xiàn)縮足、墊腳、嘶叫、掙扎、舔舐等陽性反應的時間即為PWL，超過30s者計為30；PWT測定操作：將大鼠放置在懸空金屬籠中，采用von Frey纖維絲垂直刺激左后足第2、3腳趾間，距切口約1cm，記錄出現(xiàn)陽性反應時的刺激壓力值，上限為60g。

1.2.3 Western Blot:行為學檢測完成后，將大鼠立即乙醚麻醉，而后頸椎脫臼處死。迅速縱向剪開椎弓根，充分暴露脊髓組織，取左側L4～6脊髓背角組織并保存于-80℃冰箱中。采用Western blot檢測脊髓背角PKC的表達水平：將已解凍的脊髓背角組織置于培養(yǎng)皿中，加入細胞裂解液后磨成勻漿，12 000r/min離心10min，取上清；采用總蛋白提取試劑盒(Solarbio)提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；而后經(jīng)SDS-PAGE、轉膜、封閉1h后，分別加入PKC(1∶2 000)、NR1、NR2A、NR2B(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜；次日PBS清洗3次后，加入二抗羊抗兔IgG，室溫孵育2h；PBS清洗3次后進行ECL化學發(fā)光顯影，用Image J計算灰度值比(以β-actin為內參)。

2 結果

2.1 痛覺行為學檢測 痛覺行為學檢測結果顯示，建模前(T-1)各組PWL及PWT均無顯著差異(P>0.05)；T1～T4時，與對照組相比，其余各組的PWL和PWT均顯著降低(P<0.05)；與M組及R組相比，RM組和Inhibitor組PWL和PWT均顯著降低(P<0.05)；與RM組相比，Inhibitor組PWL和 PWT顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組SD大鼠不同時間點的PWL及PWT比較

2.2 各組PKC的相對表達情況 Western Blot檢測各組PKC的相對表達量結果顯示，與對照組(0.65±0.04)相比，R組(1.36±0.08)、M組(1.52±0.10)和RM組(2.57±0.12)的PKC表達均顯著升高，且RM組顯著高于R組和M組(P<0.05)；與RM組相比，Inhibitor組PKC表達(1.02±0.10)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組PKC蛋白表達情況

2.3 各組NMDA受體蛋白表達比較 Western Blot檢測各組NMDA受體亞基的相對表達量，結果顯示，與對照組相比，其余各組NR1、NR2B的表達水平及NR2A/NR2B比值均升高，且RM組和Inhibitor組顯著高于R組和M組(P<0.05)；與RM組相比，Inhibitor組NR1、NR2B表達及NR2A/NR2B比值均降低(P<0.05)。見圖2和表2。

表2 各組脊髓背角總蛋白中NR1、NR2A、NR2B表達水平比較

圖2 各組NMDA受體蛋白表達比較

3 討論

疼痛是實際或潛在組織損傷所引起的不愉快感覺和情感體驗，由于個體化差異每個人的痛覺敏感度不同。醫(yī)學上的痛覺過敏是指病理性的疼痛反應過敏感，主要表現(xiàn)為機體對正常疼痛刺激的敏感性增加、疼痛忍耐閾值降低[8]。近年來，隨著瑞芬太尼在臨床的廣泛應用，其引起的術后痛覺過敏現(xiàn)象被越來越多的醫(yī)患和學者關注。據(jù)報道，與其他阿片類鎮(zhèn)痛藥物相比，瑞芬太尼引發(fā)痛覺過敏的發(fā)生率顯著更高，達16%以上，且一般于術后24～48h的達到痛敏高峰，而后逐漸衰弱并趨于正常[9-11]。因此，本研究檢測了各組大鼠術后2～48h的痛覺行為學指標，結果顯示，與對照組相比，R組在不同時間點的 PWL和PWT均顯著降低，RM組顯著低于M組，且在術后48h時PWL和PWT達到最低，與現(xiàn)有研究結果基本一致。

而隨著人類對痛覺敏感認知和手術質量要求的提高，RIH發(fā)生機制的研究被越來越多的學者關注，現(xiàn)有研究認為其可能涉及NMDA受體激活、離子通道、信號通路及細胞因子等多個方面，但仍缺乏具體和全面的機制研究結論[2,12]。PKC是重要的磷脂依賴性蛋白激酶，由多種同工酶組成，按其結構和功能可分為鈣依賴型PKC(α、β1、β2、γ亞類)、鈣不敏感型PKC(δ、ε、η、θ、μ亞類)和非典型PKC(λ、ζ亞類)，其中，PKCγ是神經(jīng)系統(tǒng)特有的亞型，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在脊髓組織中，PKC僅表達于脊髓背角LaminaⅡ層內側的中間神經(jīng)元中[13]。據(jù)報道，PKC參與細胞凋亡、骨架蛋白重塑以及離子通道調節(jié)等多種生物學效應過程，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導通路中充當?shù)诙攀沟慕巧?，通過調節(jié)離子通道和受體參與誘導和維持中樞痛覺敏感化過程，但其具體機制尚不清楚[14]。有文獻報道PKC參與痛覺過敏過程，其作用機制可能是通過激活NMDA受體開啟Ca2+通道，導致Ca2+內流聚集，激活PKC，活化后的PKC進一步作用于NMDA受體，使得Ca2+內流進一步加劇，形成反饋性惡性循環(huán)，導致傷害性感受信號持續(xù)傳入和增加，即引發(fā)痛覺過敏[15]。研究表明，PKC在慢性坐骨神經(jīng)壓迫疼痛和炎性疼痛模型中表達上調，而PKC抑制劑可降低脊髓中星型膠質細胞的激活程度，緩解大鼠機械痛敏[16-17]；Yuan Y等[18]的研究表明RIH大鼠脊髓背角中存在PKC異常高表達，而干擾NMDA-PKC-Ca2+/CaMKⅡ通路可預防瑞芬太尼誘導的痛覺過敏；于萍等[19]研究結果顯示在RIH術后24h后，大鼠的PWL和PWT值顯著降低，脊髓背角神經(jīng)元中PKC表達顯著上調，注射PKC抑制劑后可緩解大鼠痛覺過敏情況。本研究結果顯示，術后48h時RM組PWL和PWT值達到最低，其脊髓背角中PKC的表達水平最高，顯著高于M組和R組，提示PCK的表達水平與RIH大鼠痛覺過敏有關；而與RM組相比，PKC抑制劑組PWL和PWT值均升高，PKC表達也顯著降低，提示抑制PKC的表達在一定程度上可以抑制痛覺過敏，與現(xiàn)有研究結論基本一致。痛覺過敏產(chǎn)生的機制之一是NMDA受體的激活和傳遞神經(jīng)興奮性神經(jīng)遞質，其可以通過調節(jié)Ca2+內流等促使痛覺信號的傳遞。NR1是NMDA受體的亞基之一，其磷酸化是NMDA受體激活的標志，目前研究多采用NR1表達水平及NR2A/NR2B比值來代表NMDA受體的激活程度和痛覺敏感度的評估標準。本研究同時檢測了脊髓背角中NMDA受體的表達，結果顯示，RM組NR1、NR2B的表達水平及NR2A/NR2B比值顯著高于R組及M組，抑制劑組顯著低于RM組，提示抑制PKC的表達可能通過抑制NMDA受體的激活來抑制痛覺過敏的發(fā)生。

綜上所述，本研究表明PKC在RIH大鼠脊髓背角中高表達，可能參與RIH的發(fā)生過程。抑制PKC的表達可能通過抑制NMDA受體的激活從而抑制痛覺過敏的發(fā)生。本研究為瑞芬太尼誘導痛覺過敏的機制研究和靶向治療提供了新的思路。