非小細胞肺癌中MAGE-D4表達的初步研究

何曉娟 景 紅 孔曉煌 孫媛媛

1 河南大學淮河醫院病理科，河南省開封市 475003； 2 鄭州大學附屬鄭州市中心醫院普胸外科

相關調查研究顯示肺癌的發病率和病死率均位居第一，對人類健康危害極大[1]；其中非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌的80%～85%[2]。臨床上一部分肺癌患者確診時已處于局部進展期或晚期，5年生存率<5%，常已失去最佳治療的機會，放化療效果差[3]。

近年來免疫治療不斷發展，以抗PD-L1、PD-1為代表的免疫治療在晚期非小細胞肺癌治療中取得了令人振奮的效果，較大程度改善了晚期肺癌患者的生活質量，減輕患者痛苦、提高了生存率[4]。因此肺癌免疫治療靶抗原的研究及尋找意義重大，成為肺癌免疫治療的焦點。黑色素瘤相關抗原D4(Melanoma-associated antigen D4,MAGE-D4)，既往稱為MAGE-E1，是黑色素瘤相關抗原(MAGE)超家族的新成員，由Sasaki等[5]在2001年利用基因表達系列分析發現，是癌—睪丸抗原中一類重要成員。其在NSCLC、食管鱗狀細胞癌、腦膠質瘤、乳腺癌、原發性肝癌等惡性腫瘤中存在高表達[6-10]。MAGE-D4能否成為非小細胞肺癌基因和免疫治療的分子靶點，這些問題需要進一步深入研究。

國內外關于MAGE-D4的文獻研究數量少、樣本量不足，因此本文通過研究MAGE-D4在非小細胞肺癌中表達情況，及與各項臨床、病理特征之間的關系，以期為MAGE-D4在非小細胞肺癌中可能成為新的免疫治療靶點，提供一些基礎理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2017年1月—2020年12月河南大學淮河醫院病理科存檔NSCLC腫瘤組織蠟塊242例及其周邊正常對照組織蠟塊101例。去除嚴重破碎及漏切的腫瘤組織5例、周邊組織1例，進而所得腫瘤組織共237例，其中腺癌164例(黏液腺癌9例)，鱗癌73例，高分化44例，中—低分化193例，周邊共100例。其中男149例，女88例；年齡38～84歲，平均年齡 62.44歲。

1.2 選擇標準 納入標準：可手術切除腫瘤原發灶; 術后病理確診為非小細胞肺癌；術前未接受過放化療；周邊正常肺組織(距離腫瘤>3cm)；預期生存期超過3個月。排除標準:臨床或病理資料不完整; 肺癌復治或合并其他腫瘤；轉移性腫瘤；Ⅳ期姑息性治療病例。

1.3 臨床資料收集 收集資料包括性別、年齡、吸煙史、家族史、分期、腫瘤病理類型、腫瘤大小、分化程度、有無淋巴結轉移、有無肺被膜侵犯。病理類型及分化程度按2015年WHO 提出的肺癌組織學分類標準分期[11]。臨床分期按國際肺癌研究協會(International Association for the study of Lung Cancer,IASLC)2015年制定的第8版肺癌TNM分期[12]。

1.4 方法

1.4.1 試劑。兔抗人MAGE-D4多克隆抗體(invitrogen)按1∶200 稀釋后使用，樣本稀釋液、緩沖液、過氧化物酶阻斷劑、二抗及DAB 顯色液為購自上海杰浩生物技術有限公司的工作液。

1.4.2 組織芯片制作。使用購自廣州市秀威貿易有限公司的組織芯片蠟塊，規格2mm，60孔，把挑選好的腫瘤蠟塊及周邊正常組織蠟塊做好標記，按編好的順序使用廣州市秀威貿易有限公司的組織芯片槍在標記部位垂直鉆取組織并打入相應的組織芯片蠟塊孔。共制作6塊組織芯片蠟塊，放在45℃烤箱中15min至表面蠟相熔并冷卻至室溫。

1.4.3 切片制備。制作好的組織芯片蠟塊放在冰箱冷凍5min，切成3.5μm厚的石蠟切片，用防脫片撈片，放在65℃烤片機上烤片2h。

1.4.4 免疫組化。石蠟切片常規脫蠟、水化。放在檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中高溫抗原修復20min，3%H2O2液封閉內源性過氧化物酶10min。4℃孵育一抗過夜，常溫孵育二抗30min。DAB顯色，蘇木素染核，洗滌、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照。陽性表達組織做陽性對照，以PBS替代一抗做陰性對照。

1.4.5 結果判定。判斷標準：(高倍鏡×400)隨機選擇5個視野，染色范圍(即陽性細胞的平均百分比)評分如下：0%計0分；1%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；76%～100%計4分。染色程度(即顏色深淺)分級評分如下：0級無色，0分；1級淡黃色，1分；2級棕黃色，2分；3級棕褐色，3分。總積分(h)=染色范圍得分×染色程度評分。h<4表示陰性，h≥4表示陽性[13]。

1.5 統計學方法 所得數據采用SPSS26.0軟件進行統計分析，計數資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MAGE-D4在正常肺泡上皮和NSCLC中的表達 MAGE-D4陽性表達多數定位于細胞漿，少部分定位為細胞漿及胞核。癌旁正常肺泡上皮MAGE-D4陽性表達率為49.0%(49/100)，腫瘤組織的MAGE-D4陽性表達率80.2%(190/237)，腫瘤組織的MAGE-D4陽性表達率顯著高于癌旁正常肺泡上皮(χ2=33.13，P<0.000 1)。見圖1。

圖1 免疫組織化學法檢測MAGE-D4在腫瘤及周邊肺泡組織中的表達(IHC×200)

2.2 NSCLC組織中MAGE-D4表達與患者臨床病理因素之間的關系 實驗結果顯示，MAGE-D4陽性率與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分期、腫瘤分化程度有關(P<0.05)；而與性別、組織學類型、有無被膜侵犯、有無淋巴結轉移、家族史及吸煙史無明顯相關性(P>0.05)。見表1。

表1 非小細胞肺癌組織中MAGE-D4表達與臨床病理參數間的關系[n(%)]

3 討論

2001年，有學者發現了黑色素瘤相關抗原家族又一新成員即黑色素瘤相關抗原E1(MAGE-E1)[5]。黑色素瘤相關抗原(MAGE)主要有兩類：MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ，其中MAGE-E1屬于Ⅱ類。由于MAGE-E1染色體結構與MAGE-D非常相似，后將MAGE-E1改名為MAGE-D4。MAGE-D4具有癌—睪丸抗原的特性，即在正常組織不表達，而特異地表達于惡性腫瘤的特性[14]，且能夠特異性被T淋巴細胞識別，引起機體以細胞免疫為主的免疫反應，從而特異性識別并殺傷腫瘤細胞[15]，為MAGE成為腫瘤抗原提供理論基礎。腫瘤抗原是指在腫瘤發生、發展過程中新出現或過度表達的抗原物質總稱，分為腫瘤特異性抗原(Tumor specific antigen,TSA)及腫瘤相關抗原(Tumor associated antigen，TAA)。MAGE屬于TAA，具有極高的腫瘤特異性，為腫瘤的免疫治療帶來了希望。

NSCLC的治療以手術為主，輔助放化療、靶向、免疫等治療方式。部分晚期NSCLC 各種治療方式效果欠佳，5年生存率低[16]。近幾年免疫治療取得了新進展，其中CTLA-4、PD-L1、PD-1為現今研究最廣、最為成熟的免疫靶點，取得了較為顯著的治療效果，然而部分患者經抗PD-1、PD-L1治療后病情進展、治療無效[17]。臨床治療差異性說明單一的腫瘤生物標志物可能難以滿足臨床個體治療的需求。因此聯合檢測多種腫瘤生物標志物指標是未來的發展趨勢。

既往文獻發現MAGE-D4在NSCLC、腦膠質瘤、食管鱗癌、乳腺癌，肝癌等多種惡性腫瘤中異常高表達。本實驗結果表明，MAGE-D4在NSCLC組織較周邊正常肺泡組織表達顯著增高，表明非小細胞肺癌組織中的異常高表達(陽性率80.2%)，提示MAGE-D4有可能是非小細胞肺癌的特異性抗原的一種，與文獻報道情況相符[6, 18]。然而本實驗顯示周邊3cm以上的正常肺組織中MAGE-D4的表達率為49%,提示MAGE-D4在周邊正常肺組織有較高表達，該結果與既往文獻報道的MAGE-D4在正常肺組織幾乎不表達存在差異[8]。分析差異原因，可能是實驗方法的設計不同，在以后研究中應該增加良性疾病肺組織作為對照。然而也有可能是腫瘤周邊正常肺組織雖然光鏡下無腫瘤性改變，但在MAGE-D4蛋白水平已有變化。筆者后期將進行更多、更詳細的實驗進一步研究。

本次實驗從蛋白水平探索MAGE-D4在肺非小細胞癌中表達，發現MAGE-D4陽性率與患者年齡、腫瘤大小、分期、分化程度呈正相關；而與性別、有無肺被膜侵犯、有無淋巴結轉移、有無家族史及有無吸煙無明顯相關性，這與Sasaki等相關研究結果相吻合[5]。而Ma等[19]采用實時熒光PCR研究發現：MAGE-D4在分化差的組織及轉移的淋巴結中強表達。

綜上所述，MAGE-D4與腫瘤的發生發展及預后密切相關，其具體機制目前尚不明確，可能通過化學修飾、信號轉導、DNA損傷修復及細胞黏附與識別等方面參與腫瘤的發生和進展。本實驗相關數據提示MAGE-D4在腫瘤發生發展中可能承擔了重要角色；筆者進一步總結該抗原的相關文獻，認為MAGE-D4可能成為肺癌免疫治療的新靶點，并為晚期肺癌患者免疫治療增加了新的希望。此外，為腫瘤的免疫治療提供契機及理論基礎，需要后續更多的研究來實現。