G蛋白偶聯受體75信號通路在20-羥二十烷四烯酸誘導乳鼠心肌細胞凋亡中的作用*

劉嬌莉， 吉雨恬， 毛 凌， 郭立榮， 韓 勇

（遵義醫科大學生理學教研室，貴州 遵義 563000）

20-羥二十烷四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）是由花生四烯酸經細胞色素P450 酶途徑的CYP4A/4F 酶催化ω-羥基代謝生成的血管活性脂［1］。近年研究表明，20-HETE與多種心臟疾病的發生、發展密切相關，如冠心病、心肌梗死和心肌缺血再灌注損傷和心肌肥大等［2］，但20-HETE 引起心肌損傷的受體機制尚不清楚。

G 蛋白偶聯受體75（G-protein-coupled receptor 75，GPR75）是G 蛋白偶聯受體（G-protein-coupled re?ceptors，GPCRs）家族一員，發現以來一直被列為孤兒受體［3］。在人血管內皮細胞及大鼠主動脈平滑肌細胞中的研究中發現，20-HETE 與GPR75 具有高親和性，且20-HETE 通過綁定并激活GPR75 從而影響血管功能并引發高血壓［4］，提示GPR75 可能是20-HETE發揮心血管活動調節的作用受體。然而，在心肌細胞中是否同樣存在20-HETE-GPR75 配對機制，并介導20-HETE 的心肌損傷作用，尚鮮有研究。我們既往觀察到GPR75在大鼠H9c2心肌細胞中表達，且敲減GPR75后抑制了20-HETE 誘導的H9c2 心肌細胞凋亡［5］。在此研究基礎上，本文擬在原代培養乳鼠心肌細胞中，進一步探索GPR75 及其介導的信號通路在20-HETE 誘導心肌細胞凋亡中的作用機制。

材料和方法

1 動物

SD 大鼠的新生1～3日齡乳鼠購自長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0014。本實驗經遵義醫科大學實驗動物倫理委員會同意，符合中國國家實驗動物倫理的相關規定。

2 主要試劑

20-HETE 購自Cayman Chemical；慢病毒包裝試劑盒購自GeneCopoeia；U73122、2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯（2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）、GF109203X 和apocynin 購自MCE；兔抗GPR75 抗體和小鼠抗細胞色素C（cytochrome C，CytC）抗體購自CST；小鼠抗caspase-3 抗體購自Abcam；抗β-actin 抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的Ⅱ抗購自Proteintech；逆轉錄試劑盒及熒光SYBR Green I 購自TaKaRa；TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒、鈣熒光探針Fluo-3/AM 和二氫乙啶（dihy?droethidine，DHE）熒光探針購自北京索萊寶生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自江萊生物。

3 主要方法

3.1 心肌細胞的原代培養按照本實驗室前期建立的方法進行原代SD 乳鼠心肌細胞體外培養［6］。0.25%胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶在37 ℃磁力攪拌恒溫水浴鍋中重復消化SD 大鼠新生1～3 d 乳鼠心臟組織，200 ×g離心10 min 收集細胞沉淀，加入含15% 胎牛血清、青霉素和鏈霉素（1×105U/L，0.1 mg/L）的DMEM/F12 培養液于5% CO2培養箱中37 ℃條件下培養90 min，利用差速貼壁法將分離的心肌細胞懸液加入5?溴脫氧尿嘧啶核苷（100 μmol/L）置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

3.2 慢病毒重組載體轉染參考我們已報道的方法進行慢病毒轉染［5］。GPR75shRNA（shGPR75）的靶向序列為：5'-CCCTATCCCTTCTGTTTAATA-3'。shControl 靶向序列為：5'-ACAGAAGCGATTGATC-3'。在培養的心肌細胞融合度為60%～70% 時，將滴度為1×1011TU/L的慢病毒重組載體shGPR75和相應空載體shControl 轉染至心肌細胞，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，RT-qPCR 和Western blot 檢測轉染效率。

3.3 實驗分組shControl轉染對照組（control組）與慢病毒轉染組（shGPR75 組）細胞在相同條件下培養24 h 后，開展后續實驗。培養的乳鼠心肌細胞使用20-HETE（100 nmol/L）孵育處理24 h（20-HETE 組），其他組別細胞依據不同實驗目的，在20-HETE 處理前1 h，參考相關文獻分別加入不同濃度的預處理藥物：U73122（1 μmol/L）、2-APB（100 μmol/L）、GF109203X（1 μmol/L）和apocynin（100 μmol/L）進行藥物干預，培養24 h后收集細胞進行相關指標檢測。

3.4 RT-qPCR檢測GPR75 mRNA 表達水平Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA 進行實時熒光定量實驗，GPR75 的上游引物序列為5'-GCCA?CAAGCCTGGTCTACAAA-3'，下游引物序列為5'-GT?GCTCTGGTGCCTGCGATAC-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3'，下游引物序列為5'-ACACCGACCTTCACCATCT-3'。反應條件為：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃30 s，共40個循環。實驗結果以GAPDH 作為內參照，采用2?ΔΔCt進行結果分析。

3.5 Western blot 檢測GPR75、CytC 和caspase-3 蛋白水平各分組細胞經不同藥物處理后，RIPA 裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，取等量蛋白進行SDS-PAGE，轉膜后封閉，分別加入兔抗GPR75 多克隆抗體（1∶300）、小鼠抗Cyt C抗體（1∶300）、小鼠抗caspase-3 抗體（1∶500）和小鼠抗β-actin 單克隆抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，再加入抗小鼠HRP-IgG（1∶5 000）及抗兔HRP-IgG（1∶5 000）Ⅱ抗，室溫孵育1 h，ECL 法顯影，采用ImageJ 1.48軟件分析目標蛋白及內參照的灰度計算蛋白表達相對含量。

3.6 ELISA 法檢測三磷酸肌醇（inositol triphos?phate，IP3）含量及蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和NADPH 氧化酶活性按照廠商提供的ELISA 試劑盒說明書操作，各組細胞取等量蛋白提取液，加入所對應的HRP 標記的檢測抗體，37 ℃孵育1 h 后洗板5 次，加底物顯色劑后避光孵育15 min，最后加入終止液停止反應，在酶標儀450 nm 波長下測各孔吸光度（A）值。繪制線性標準曲線，計算細胞內IP3含量以及PKC和NADPH氧化酶活性。

3.7 Fluo-3/AM 法檢測Ca2+含量將細胞接種于共聚焦皿，藥物處理后，加入5 %的Pluronic F?127 及Fluo?3/AM（5 μmol/L）熒光探針37 ℃避光孵育50 min，激光共聚焦顯微鏡觀察，激發波長488 nm、發射波長525 nm 下產生綠色熒光，ZEN 2.3 軟件分析平均綠色熒光強度。

3.8 DHE 熒光探針檢測活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量將細胞接種于共聚焦皿，藥物處理后，加入DHE 熒光探針37 ℃避光孵育40 min，激光共聚焦顯微鏡觀察，激發波長510 nm、發射波長580 nm 下產生紅色熒光，采用ZEN 2.3 軟件分析平均紅色熒光強度。

3.9 TUNEL染色檢測細胞凋亡4% 多聚甲醛固定各分組細胞，TUNEL 工作液37 ℃避光孵育1 h，DAPI溶液避光復染細胞核，抗熒光衰減劑封片。熒光顯微鏡下隨機挑選5個200倍視野，統計每個視野中的凋亡細胞數目（綠色熒光）與總細胞數目（藍色熒光）的比值即為凋亡率。

4 統計學處理

用SPSS 17.0 統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD 法）。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 敲減GPR75 及20-HETE 對乳鼠心肌細胞GPR75表達影響

與control 組相比，慢病毒shGPR75 轉染組乳鼠心肌細胞內GPR75 的mRNA 表達水平降低（P<0.05）；使用20-HETE（100 nmol/L）處理乳鼠心肌細胞24 h 后，GPR75 mRNA 水平較control 組升高（P<0.05）。與mRNA 表達一致，shGPR75 組GPR75 蛋白表達亦較control 組顯著降低（P<0.05）；經20-HETE處理后，細胞內GPR75 蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），見圖1。

2 敲減GPR75 及磷脂酶C（phospholipase C，PLC）抑制劑U73122 對20-HETE 誘導心肌細胞內IP3生成的影響

ELISA 檢測結果顯示，與control 組相比，乳鼠心肌細胞使用20-HETE 處理后，細胞內IP3含量升高（P<0.05）；與20-HETE 組相比，敲減GPR75或應用PLC 抑制劑U73122 處理可顯著抑制20-HETE 誘導IP3生成的作用（P<0.05）；與control組相比，shGPR75組和U73122組IP3無顯著改變（P>0.05），見圖2。

3 敲減GPR75 及U73122、IP3 受體（IP3 receptor，IP3R）阻斷劑2-APB 對20-HETE 誘導的細胞內Ca2+濃度的影響

Figure 1.Effects of GPR75 knockdown or 20-HETE administration on mRNA and protein expression of GPR75 in NRCMs.Mean ±SD. n = 4.*P < 0.05 vs control group；#P< 0.05 vs 20-HETE group.圖1 敲減GPR75及20-HETE對乳鼠心肌細胞GPR75表達的影響

Figure 2.Effects of GPR75 knockdown or PLC inhibitor U73122 administration on the 20-HETE-induced IP3 production in NRCMs.20 ? HETE-treated induced a significant increase in IP3 production.Knockdown of GPR75 or pre-treatment with U73122 blocked the ef?fects of 20-HETE-indeuced IP3 production.Mean±SD. n=4.*P< 0.05 vs control group；#P< 0.05 vs 20-HETE group.圖2 敲減GPR75 及U73122 對20-HETE 誘導心肌細胞內IP3生成的影響

激光共聚焦檢測結果顯示，與control 組相比，20-HETE 處理組乳鼠心肌細胞內Ca2+濃度（［Ca2+］i）升高（P<0.05）；而敲減GPR75或應用PLC 抑制劑U73122處理可顯著抑制20-HETE 誘導Ca2+濃度升高效應（P<0.05）；此外，與20-HETE 組相比，IP3R 阻斷劑2-APB 預處理亦可減少細胞內Ca2+濃度（P<0.05）；與control 組相比，單獨shGPR75 組、U73122組 以 及2-APB 組［Ca2+］i無顯著變化（P>0.05），見圖3。

4 敲 減GPR75 及PKC 抑制劑GF109203X、NADPH 氧化酶抑制劑apocynin 對20-HETE 誘導ROS生成的影響

DHE 熒光染色結果顯示，與control 組相比，20-HETE 處理組乳鼠心肌細胞內ROS 含量顯著升高（P<0.05）；而敲減GPR75或應用PKC抑制劑GF109203X 處理可顯著抑制20-HETE 誘導細胞內ROS 生成（P<0.05）；此外，與20-HETE 組相比，應用NADPH 氧化酶抑制劑apocynin 后，細胞內ROS 生成亦減少（P<0.05）；與control 組相比，單獨shGPR75組、GF109203X 組以及apocynin 組ROS 含量均無顯著改變（P>0.05），見圖4。

5 敲減GPR75 對20-HETE 誘導心肌細胞PKC 及NADPH氧化酶活性的影響

ELISA 檢測結果顯示，與control 組相比，20-HETE處理組乳鼠心肌細胞內PKC和NADPH氧化酶活性均顯著升高（P<0.05）；而敲減GPR75后，20-HETE誘導的心肌細胞內PKC和NADPH氧化酶活性顯著降低（P<0.05）；shGPR75 組與control 組相比，PKC 和NADPH 氧化酶活性無顯著差異（P>0.05），見圖5。

Figure 3.Effects of knockdown of GPR75，pre-treatment with PLC inhibitor U73122 or IP3R inhibitor 2-APB on the 20-HETE-in?duced increase of ［Ca2+］i in NRCMs by Fluo-3/AM staining.Mean ± SD. n= 4.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 20-HETE group.圖3 敲減GPR75及U73122、2-APB預處理對20-HETE誘導心肌細胞內Ca2+濃度的影響

6 敲減GPR75 及U73122、GF109203X 對20-HETE誘導心肌細胞凋亡的影響

TUNEL 檢測結果顯示，與control 組相比，20-HETE 處理組心肌細胞凋亡率顯著增加（P<0.05）；同時，Western blot結果顯示，20-HETE 組心肌細胞凋亡相關蛋白CytC 以及caspase-3 蛋白表達顯著升高（P<0.05）；而敲減GPR75表達則顯著抑制了20-HETE的如上作用（P<0.05）；同時，使用U73122阻斷PLC 信號通路或者使用GF109203X 阻斷PKC 信號通路后，20-HETE 誘導的心肌細胞凋亡和CytC、cas?pase-3 蛋白表達均被抑制（P<0.05）；與control 組相比，單獨shGPR75 組、U73122 組或GF109203X 組心肌細胞凋亡率、CytC 和caspase-3 蛋白表達水平均無顯著改變（P>0.05），見圖6。

討 論

GPR75 受體自發現以來一直被列為孤兒受體［3］，在對其進行去孤兒化的研究中，有學者［7-9］首先報道炎性趨化因子CCL5具有激活GPR75受體作用，并通過該受體參與神經細胞功能保護以及胰島素分泌等作用，但如上研究并未提供CCL5與GPR75受體直接綁定的實驗證據。Garcia 等［4］報道在人內皮細胞及大鼠平滑肌細胞中，20-HETE 可通過激活并綁定GPR75 受體影響血管功能并引發高血壓。隨后Cárdenas 等［10］和Gilani 等［11］分別在前列腺癌PC-3 細胞和3T3-1 分化的脂肪細胞中，同樣觀察到20-HETE-GPR75 受體配對機制，并在腫瘤細胞惡性轉化、胰島素的合成與分泌等方面發揮重要作用。在最新的一項研究中，Pascale 等［12］進一步報道了20-HETE 是GPR75 受體的高親和力配體，而CCL5 則起到抑制20-HETE 激活GPR75 受體信號通路的作用。如上研究提示20-HETE可能是GPR75受體的天然配體，但尚需在多種組織器官中加以證實。心臟是20-HETE 發揮生理、病理調節作用的重要器官，但心肌組織中是否表達GPR75受體并介導20-HETE的生物作用，目前鮮有報道。

Figure 4.Effects of GPR75 knockdown，PKC inhibitor GF109203X or NADPH oxidase inhibitor apocynin on 20-HETE-induced ROS generation in NRCMs（DHE staining）.Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 20-HETE group.圖4 敲減GPR75及GF109203X、apocynin對20-HETE誘導的心肌細胞ROS生成的影響

Figure 5.Effects of GPR75 knockdown on activity of PKC and NADPH oxidase in NRCMs induced by 20-HETE.Mean±SD. n=4.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 20-HETE group.圖5 敲減GPR75 對20-HETE 誘導的心肌細胞內PKC 及NADPH氧化酶活性的影響

Figure 6.Effects of knockdown of GPR75，PLC inhibitor U73122 or PKC in hibitor GF109203X on 20-HETE-induced apoptosis in NRCMs.A：representative images of TUNEL staining；B：bar graph representing percentages of apoptotic cells；C：the pro?tein levels of Cyt C and caspase-3 detected by Western blot.Mean±SD. n=5.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs 20-HETE group.圖6 敲減GPR75及U73122、GF109203X對20-HETE誘導的心肌細胞凋亡的影響

我們既往及本研究觀察到，在大鼠H9c2 細胞和乳鼠心肌細胞中，GPR75 受體在mRNA 及蛋白水平表達，且20-HETE 孵育后可顯著促進培養的乳鼠心肌細胞中GPR75的表達。當采用慢病毒轉染方法敲減GPR75表達后，顯著抑制了20-HETE 誘導的心肌細胞凋亡。應用慢病毒載體轉染方法進行干擾RNA基因表達，相比于傳統的轉染試劑法、電穿孔法和脂質體法等轉染細胞，該方法具有感染廣泛、基因組整合穩定、轉移基因可長期表達等特點［13］。有比較研究表明，對于心肌細胞采用病毒載體進行基因干擾相比于其他方法更為高效和穩定［14］。Consonni 等［15］在培養的乳鼠心肌細胞中報道，采用慢病毒轉染干擾基因表達可防止心肌細胞超微結構及功能損傷。因此，本研究采用了慢病毒轉染降低乳鼠心肌細胞GPR75基因表達，觀察其對20-HETE 誘導的心肌細胞凋亡作用的影響。

GPR75被激活后可活化與其偶聯的Gαq蛋白，后者經細胞膜PLC 水解磷脂酰肌醇4，5 二磷酸生成細胞內重要第二信使—IP3，并最終激活細胞內相關信號通路［4，16］。因此，細胞內IP3累積被認為是GPCRs激活的重要標志物。本研究觀察到20-HETE 具有促進細胞內IP3生成的作用，且敲減GPR75表達或者使用U73122 抑制PLC 作用均可阻斷20-HETE 的該效應，提示在心肌細胞中20-HETE 具有激活GPR75 德作用。但是，后續研究中需要深入觀察20-HETE 對GPR75受體的內化激活、招募β-arrestin、下游信號激酶的磷酸化等方面的作用，以進一步確定20-HETE與GPR75在心肌細胞中的配對機制。

IP3生成增加還可激活細胞內IP3受體門控通道引起肌漿網內Ca2+釋放，導致Ca2+調控紊亂從而誘發細胞內鈣超載［17］。Ca2+在心肌細胞的功能與代謝活動中發揮關鍵性的調節作用，Ca2+調控的穩態失衡不僅影響心肌細胞收縮、舒張功能，且由其引發的鈣超載是心肌損害的最終通路［18］。我們之前的研究曾報道，20-HETE 具有升高心肌細胞［Ca2+］i的作用，是誘導心肌細胞凋亡繼而造成缺血性心肌損傷的重要機制［6，19］。在本研究中觀察到，敲減GPR75表達、阻斷PLC 信號通路或者抑制IP3R 受體作用后，20-HETE誘導的心肌細胞內［Ca2+］i升高效應均被顯著逆轉，提示20-HETE-GPR75 受體配對在造成心肌細胞鈣超載繼而誘導細胞凋亡方面發揮重要作用，其機制與GPR75 受體激活后介導的PLC/IP3/Ca2+信號通路密切相關。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）過量生成是誘導心肌細胞凋亡、加重心肌損傷的另一重要因素。ROS 的過量生成將引起細胞發生氧化應激反應，導致細胞內多種亞細胞成分過氧化損傷，如降解膜磷脂，攻擊蛋白質及損傷DNA，最終引起細胞凋亡，而且由于心肌組織中缺乏抗氧化酶，其對于ROS的敏感性要高于其他組織器官［20-21］。NADPH 氧化酶是促進心肌細胞內ROS 生成的重要來源［22］，且我們前期研究觀察到，在大鼠離體心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）模 型中，20-HETE 可通過激活NADPH 氧化酶途徑誘導細胞內ROS過量生成，從而誘導心肌細胞凋亡，最終加重再灌注后心肌梗死面積的發生［23］。另外一項研究表明，在培養乳鼠心肌細胞中，20-HETE 通過PKC 依賴機制激活NADPH 氧化酶從而誘導ROS生成［19］；此外，20-HETE 還可通過誘導ROS 生成參與血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡［24］。與上述研究一致，在本實驗中觀察到，應用PKC 抑制劑GF109203X 或者NADPH 氧化酶抑制劑apocynin 預處理均可減少20-HETE 誘導的細胞內ROS 生成。而敲減GPR75表達后，除細胞內ROS 生成顯著減少外，20-HETE 誘導的PKC 以及NADPH 氧化酶活性亦顯著降低。如上結果提示，20-HETE 可通過GPR75 受體發揮促細胞內ROS 生成作用，其機制與GPR75 受體介導的PKC/NADPH/ROS 信號通路有關。最后，本實驗還觀察到敲減GPR75表達、應用PLC 抑制劑U73122 以及PKC抑制劑GF109203X處理可顯著抑制20-HETE誘導的乳鼠心肌細胞凋亡，同時顯著下調細胞凋亡相關蛋白Cyt C和caspase-3蛋白的表達。

綜上所述，敲減GPR75可阻斷20-HETE 誘導的乳鼠心肌細胞凋亡，GPR75 介導的PLC/PKC 信號通路參與了20-HETE 誘導的細胞凋亡進程，提示敲減GPR75或者阻斷GPR75下游信號通路的作用可能是減少20-HETE 導致實驗動物心肌損傷的有效策略，后續實驗需在大鼠MIRI 或心肌梗死等模型中進一步研究證實。