七氟烷對(duì)衰老模型大鼠認(rèn)知功能的影響及機(jī)制初探*

周駿潔， 張 超， 楊鑫鑫， 方 旭， 朱昭瓊

（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，貴州 遵義 563300）

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dys?function，POCD）是一種常見(jiàn)的以老年患者圍手術(shù)期腦損傷為特征的臨床綜合征，常表現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力和記憶力減退［1］。許多研究表明，神經(jīng)炎癥是POCD 發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［2-3］，然而神經(jīng)炎癥參與POCD 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未闡明。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization do?main-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是由NLRP3、含caspase 募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）及caspase-1 前體（pro-caspase-1）組成。NLRP3 炎癥小體在機(jī)體受到異常刺激時(shí)會(huì)觸發(fā)caspase-1 的裂解和激活，剪切和分泌白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18，即NLRP3 炎癥小體是控制IL-1β 及IL-18 成熟的關(guān)鍵上游靶標(biāo)［4］。研究顯示NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與異氟烷誘導(dǎo)老年小鼠認(rèn)知功能障礙，值得注意的是，年幼動(dòng)物在相同干預(yù)條件下幾乎不會(huì)發(fā)生神經(jīng)炎癥或認(rèn)知功能障礙［5］。

MCC950 是新近發(fā)現(xiàn)的NLRP3 炎癥小體抑制劑。最近一項(xiàng)研究比較各種炎癥抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)報(bào)告，肯定了MCC950 的高穩(wěn)定性［6］，且MCC950在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均顯示出良好的抗炎作用及顯著的腦保護(hù)作用［7-8］。D-半乳糖作為經(jīng)典的快速致衰老模型大鼠用藥，可模擬自然衰老大鼠如免疫系統(tǒng)［9］、循環(huán)系統(tǒng)［10］及神經(jīng)系統(tǒng)［11］的全面衰老特征。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察七氟烷（sevoflurane，Sev）對(duì)衰老模型大鼠認(rèn)知能力及前額葉皮質(zhì)炎癥因子表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制，以期為臨床治療POCD提供參考資料。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)4 月齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，體重約320～350 g，均由長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司提供［許可證號(hào)：SCXK（湘）20114-0011］。所有大鼠均自由進(jìn)食水，晝夜交替12 h/12 h，環(huán)境濕度維持40%～50%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［倫審（2019）2-044］。

2 主要試劑

D-半乳糖（Solarbio，D8310）；Sev（魯南貝特制藥有限公司，批號(hào)：65190902）；MCC950（MedChemEx?press，HY-12815A）；水合氯醛（Solarbio，T8590）；BCA 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Solarbio，PC0020）；兔抗離子鈣結(jié)合接頭分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，Iba-1）抗體（Abcam，ab178846）；兔抗NLRP3、兔抗csapase-1 和兔抗ASC 抗體均購(gòu)自Novus；IL-1β 和IL-18 抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司；IL-1β 和IL-18 ELISA 試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（Abcam，ab205718）；內(nèi)參照GAPDH 抗體（Proteintech）；蛋白Marker（Thermo，26616）；0.22 μm PVDF 膜（Merck，ISEQ00010）；Western HRP 發(fā)光底物（Merck，WBKLS0100）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 大鼠衰老模型建立參照文獻(xiàn)［12］，將半乳糖（125 mg·kg?1·d?1）于大鼠頭頸部皮下持續(xù)注射42 d建立衰老模型大鼠。

3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組大鼠按SPSS 隨機(jī)數(shù)字法分為4 組：空白對(duì)照（control，Con）組、MCC950 組、Sev 組和MCC950 治療（Sev+MCC950）組，每組12 只。其中MCC950 組及Sev+MCC950 組分別吸入運(yùn)載氣體（V氧氣∶V空氣=3∶1）和3.2% Sev+運(yùn)載氣體6 h，之后30 min、24 h 和48 h 腹腔注射MCC950（10 mg·kg?1·d?1）；Con 組及Sev 組大鼠分別吸入運(yùn)載氣體和Sev 6 h，之后30 min、24 h和48 h注射等體積生理鹽水。

3.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試在直徑120 cm、深60 cm 的圓形水池中進(jìn)行。逃逸平臺(tái)是一個(gè)直徑15 cm，高30 cm 的圓柱形結(jié)構(gòu)，并浸沒(méi)在水面以下1 cm處。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：持續(xù)5 d，將大鼠尾部朝盆壁前輕輕放入池中三個(gè)象限之一，每個(gè)位置都位于除平臺(tái)外不同象限的盆壁中心。大鼠游至平臺(tái)時(shí)間即為逃避潛伏期，最大游泳時(shí)間設(shè)置為120 s，如果大鼠游泳120 s 后仍未找到平臺(tái)，大鼠將被輕輕引導(dǎo)到平臺(tái)上，并允許停留20 s；（2）工作記憶實(shí)驗(yàn)：通過(guò)移除逃逸平臺(tái)對(duì)各組大鼠進(jìn)行工作記憶測(cè)試，記錄游泳總距離、游泳速度及逃逸平臺(tái)所用時(shí)間。

3.4 HE染色行為學(xué)結(jié)束后，取6只大鼠麻醉后冰上斷頭取全腦和肺，立即固定于4%溶液中24 h，后送于遵義醫(yī)科大學(xué)病理科進(jìn)行脫水，石蠟包埋，切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化數(shù)秒后，自來(lái)水沖洗10 min 返藍(lán)，伊紅染色1 min，自來(lái)水沖洗后梯度乙醇水合，二甲苯透明，封片，觀察。

3.5 Western blot取余下6 只大鼠，麻醉后冰上斷頭取出大鼠前額葉皮質(zhì)，分為左側(cè)和右側(cè)，取左側(cè)前額葉皮質(zhì)在RIPA 裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物中勻漿，低溫高速（4 ℃、15 000×g）離心20 min 后取上清液體進(jìn)行BCA 定量，制備上樣蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，然后，將膜與相應(yīng)Ⅰ抗在4 ℃下?lián)u床孵育過(guò)夜（本研究中使用的Ⅰ抗除內(nèi)參照抗體稀釋比為1∶2 000，其余稀釋比均是1∶1 000）。次日TBST緩沖液洗滌3次后，ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光。

3.6 ELISA 檢測(cè)前額葉皮質(zhì)區(qū)及血清炎癥因子表達(dá)水平將大鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，腹主動(dòng)脈進(jìn)行取血，離心，取血清，冰上斷頭取出大鼠前額葉皮質(zhì)右側(cè)，并加入預(yù)冷PBS 制備組織超聲勻漿，4 ℃、15 000×g離心15 min后，取上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行IL-1β和IL-18水平的測(cè)定。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。水迷宮重復(fù)測(cè)量采用球形檢驗(yàn)后單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖1A 所示，在定位航行測(cè)試中，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠逃避潛伏期呈逐漸縮短且穩(wěn)定的趨勢(shì)（P>0.05）。如圖1B 所示，在工作記憶測(cè)試中，與Con 組比較，Sev 組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P<0.05）；與Sev 組對(duì)比，Sev+MCC950 組大鼠逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05）。如圖1C、D所示，各組大鼠游泳路程和游泳速度的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

Figure 1.Effects of sevoflurane（Sev）on learning and memory of the rats in each group.A：escape latency in navigation test；B：es?cape latency in working memory test；C：total distance；D：swimming speed.Mean±SD. n=12.*P<0.05 vs control（Con）group；#P<0.05 vs Sev group.圖1 七氟烷對(duì)老年模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2 大鼠肺組織和大腦前額葉皮質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察

如圖2 所示，大鼠肺臟病理切片HE 染色結(jié)果提示各組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整光滑，除Con 組外，其余各組有少量出血和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

如圖3所示，與Con組比較，MCC950組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形或錐形，細(xì)胞核位于胞核中央，無(wú)顯著神經(jīng)元損傷及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Sev 組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)部分神經(jīng)元細(xì)胞體積縮小，神經(jīng)元細(xì)胞胞核固縮深染，神經(jīng)元細(xì)胞受損；與Sev 組對(duì)比，Sev+MCC950 組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，大部分神經(jīng)元細(xì)胞形狀呈圓形或錐形，神經(jīng)元細(xì)胞損傷程度減輕。

Figure 2.HE staining of lungs in each group（scale bar=50 μm）.A：Con group，B：MCC950 group，C：Sev group；D：Sev+MCC950 group.圖2 七氟烷干預(yù)后各組大鼠肺部HE染色觀察結(jié)果

Figure 3.HE staining of prefrontal cortex of rats in each group（scale bar =50 μm）.A：Con group；B：MCC950 group；C：Sev group；D：Sev+MCC950 group.圖3 七氟烷干預(yù)后各組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)HE染色觀察結(jié)果

3 Western blot蛋白表達(dá)結(jié)果分析

如圖4所示，與Con組比較，Sev組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)區(qū)Iba-1、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），各組ASC 蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（P<0.05）；與Sev 組相比，Sev+MCC950組Iba-1、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和IL-18 蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05）。

Figure 4.Western blot analysis of Iba-1，NLRP3，ASC，caspase-1，IL-1β and IL-18 in the prefrontal cortex of rats.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs Con group；#P<0.05 vs Sev group.圖4 大鼠前額葉皮質(zhì)中Iba-1、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)

4 大鼠前額葉皮質(zhì)及血清中IL-1β 和IL-18 的檢測(cè)結(jié)果

ELISA 結(jié)果顯示，與Con組比較，Sev組大鼠前額葉皮質(zhì)及血清炎癥因子IL-1β 和IL-18的表達(dá)水平顯著高于Con 組（P<0.05），而與Sev 組 相比，Sev+MCC950組大鼠前額葉皮質(zhì)及血清炎癥因子IL-1β和IL-18的表達(dá)水平顯著減少（P<0.05），見(jiàn)表1、2。

表1 各組大鼠血清炎癥因子表達(dá)水平Table 1.The serum levels of inflammatory factors in the rats of each group（μg/L.Mean±SD. n=12）

表2 各組大鼠大腦前額葉皮質(zhì)炎癥因子表達(dá)水平Table 2.The prefrontal cortex levels of inflammatory factors in the rats of each group（μg/L.Mean±SD. n=6）

討 論

為更好探討Sev 對(duì)老年大鼠認(rèn)知能力的影響及機(jī)制，建立一個(gè)合適的研究模型極為重要。本研究中，我們觀察到各組大鼠肺部組織結(jié)構(gòu)無(wú)顯著破壞，且Sev 組僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示Sev 和MCC950對(duì)大鼠肺部組織無(wú)損害作用，可以作為神經(jīng)炎癥的可靠模型進(jìn)行后續(xù)研究。

水迷宮已被廣泛用于評(píng)估嚙齒類(lèi)動(dòng)物認(rèn)知行為能力的有效手段［13］。本研究數(shù)據(jù)表明，各組大鼠學(xué)習(xí)能力基線一致，可排除先天愚鈍型大鼠。Sev干預(yù)后，Sev 組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，表現(xiàn)在逃避潛伏期和工作記憶時(shí)間顯著增加，提示Sev誘導(dǎo)的衰老模型大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙，該結(jié)果與其他的相關(guān)報(bào)道一致［14-16］。而經(jīng)MCC950 治療后，Sev+MCC950組大鼠記憶能力都顯著提高，提示MCC950 在一定程度上可以緩解Sev 導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害。有趣的是，Sev并未影響大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。

研究表明，大腦前額葉皮質(zhì)區(qū)是調(diào)控自發(fā)性活動(dòng)、注意力、學(xué)習(xí)記憶等高階認(rèn)知能力的重要腦區(qū)，對(duì)外界刺激尤其是炎癥因子十分敏感，過(guò)高的炎癥因子對(duì)認(rèn)知功能會(huì)產(chǎn)生損害［17］。另有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞受到損傷刺激時(shí)會(huì)迅速增殖活化，釋放多種炎癥因子誘發(fā)神經(jīng)炎癥，Iba-1 作為小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活化的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)水平代表著腦內(nèi)神經(jīng)炎癥水平［18-19］。因而我們推測(cè)這可能與Sev 激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量炎癥因子有極大的關(guān)系。結(jié)果和我們預(yù)想的一致，Sev導(dǎo)致大鼠前額葉皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞受損，同時(shí)Iba1 蛋白表達(dá)水平顯著升高，MCC950治療后抑制了大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化，且顯著減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷情況。這一結(jié)果提示，MCC950提高大鼠抗炎能力，抑制大量炎癥所致的大腦損傷，改善大鼠認(rèn)知能力。

研究表明，NLRP3 炎癥小體可以在神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)［20］。基于此，我們觀察到Sev顯著增加大鼠前額葉皮質(zhì)中NLRP3 和caspase-1 蛋白表達(dá)水平，同時(shí)觀察到IL-1β 和IL-18炎癥水平表達(dá)增加，而MCC950 治療后逆轉(zhuǎn)了這些結(jié)局的發(fā)生。最近研究報(bào)道，MCC950可減輕腦損傷及相應(yīng)的炎癥信號(hào)［21］也支持了這一觀點(diǎn)。另外，我們觀察到各組ASC 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有研究表明，IL-1β 和IL-18 合成與分泌受到其他蛋白通道的調(diào)控，然而與NLRP3 炎癥小體相關(guān)的只有蛋白激酶D 被報(bào)道［22］，是否還有其他通道的參與目前尚未可知。因此我們推測(cè)其他蛋白（如蛋白激酶D等）可能參與NLRP3炎癥小體的組成。同時(shí)，我們的研究結(jié)果進(jìn)一步表明MCC950 是NLRP3 炎癥小體抑制劑，且可減輕Sev 導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害，抑制NLRP3 炎癥小體活化及下游炎癥因子表達(dá)。

本研究有一定的局限性：首先，大鼠在Sev 暴露期間未進(jìn)行任何手術(shù)刺激，NLRP3 炎癥小體激活情況與手術(shù)之間的關(guān)系尚不清楚；其次，在本研究中僅使用雄性大鼠來(lái)避免雌激素和孕激素的干擾可能會(huì)對(duì)學(xué)習(xí)和記憶有潛在影響。我們下一步擬對(duì)本研究中的不足之處再進(jìn)行深入探討。

綜上所述，Sev 導(dǎo)致衰老模型大鼠認(rèn)知功能障礙及前額葉皮質(zhì)神經(jīng)炎癥發(fā)生，其機(jī)制可能與Sev活化小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3 炎癥小體，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1β 和IL-18炎癥因子水平升高有關(guān)。