母體肥胖對胚胎神經管發育及線粒體結構和功能的影響*

路志國， 吳曉婷， 霍 泉， 李 婷， 魯 瑤， 尹荷晴， 王 凱， 杜 勇△

（1寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏 銀川 750004；2寧夏醫科大學總醫院小兒外科，寧夏 銀川 750004）

肥胖是一種由遺傳、環境、飲食等因素引起的慢性代謝性疾病［1-2］，據估計到2025 年，全球男性肥胖率將達到18%，女性為21%［3］。妊娠期肥胖不僅有妊娠并發癥［4］、妊娠期糖尿病［5］、分娩并發癥［6］和感染［7］的風險，而且對后代的發育和健康也有影響［8-9］，包括神經發育障礙（包括腦性癱瘓）、冠心病、中風、2型糖尿病和哮喘等［10-11］。由于目前對神經發育障礙的治療有限，妊娠期肥胖對胎兒神經系統發育的影響尤其令人擔憂。因此，有必要深入了解妊娠期肥胖對后代神經發育的影響及其具體機制，從而實施有效的預防策略和早期干預。

神經系統的發育始于胚胎早期，發育過程中容易受到外部因素的影響，如孕期接觸農藥、輻射、用藥、飲酒、感染和營養不良等因素［12］，導致神經管發育相關基因的結構改變或表達障礙，從而導致神經管缺陷的發生［13］。研究發現，在調整年齡、職業、文化程度、家庭收入、葉酸使用等因素后，與正常體重相比，孕前肥胖孕婦的胚胎出現神經管缺損的風險顯著增加［14］。研究發現，母親肥胖可能與胎兒脊柱裂風險增加有關，母親體重不足可能與胎兒無腦風險增加有關［15］。也有研究發現母體肥胖可通過改變表觀遺傳機制導致胚胎神經發育障礙，如胚胎神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）、自閉癥、唐氏綜合征、Rett 綜合征以及隨后的神經心理缺陷［16］。這些研究表明，母體肥胖可能會影響子代神經系統的發育，導致神經管畸形等出生缺陷，但具體機制尚不清楚。因此，本研究旨在探討高脂飲食誘導的母體肥胖對胚胎神經管發育的影響及其可能機制，為研究神經管畸形的發病機制提供線索。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物16 只SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠（6周齡，19～21 g），隨機分為正常飲食（normal diet，ND）組及高脂飲食（high-fat diet，HFD）組，每組8只。兩種飲食具體配方如表1 所示。所有動物飼養在寧夏醫科大學實驗動物中心，室溫（22±2）℃，晝夜各12 h 明暗交替。動物實驗方案經寧夏醫科大學實驗動物使用與管理委員會批準，批準號為IACUC-NYL?AC-2020-066。

表1 飲食配方Table 1.Diet formula

1.2 主要試劑全蛋白提取試劑盒購自凱基生物公司；枸櫞酸鈉抗原修復液、DAB 顯色液、山羊血清購自中杉金橋公司；HE 染色試劑盒、改良油紅O 染色試劑盒、線粒體提取試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、ATP 檢測試劑盒購自碧云天公司；抗nestin、Bax、Bcl-2、GAPDH 抗體購自Abcam 公；高脂飼料購自北京科澳協力飼料有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組將16 只SPF 級雌性C57BL/6J 小鼠隨機分為ND 組及HFD 組，每組8只分別給予高脂飼料和正常飼料。每周在特定時間測量小鼠體重，連續喂食12周后，于晚上8點將雌鼠與雄鼠合籠，次日上午8 點觀察有陰栓的雌鼠記為妊娠第0.5 天。妊娠第14.5 天后腹腔注射1% 戊巴比妥鈉（0.05 mg/g）麻醉，分離血液、肝臟和胚胎，其中ND 組共獲得73只胚胎，HFD 組共獲得70 只胚胎。用顯微鑷在解剖顯微鏡下劃開背部皮膚，小心剝離出胚胎神經管用于后續實驗。

2.2 血脂測量采用全自動生化分析儀檢測兩組血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density liptein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density liptein cholesterol，LDL-C）的含量。

2.3 HE 染色將分離的肝臟和胚胎在4% 多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用新鮮PBS 溶液沖洗。乙醇梯度（乙醇濃度70%、80%、90%、95%、100%、100%）脫水，二甲苯透明，然后在65 ℃下浸泡石蠟Ⅰ和Ⅱ融化2 h 后包埋。將切好的石蠟切片在65 ℃烘箱中干燥2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水浸泡1 min，蘇木精染色3 min，1% 鹽酸乙醇分化，伊紅染色3 min。經梯度乙醇脫水后，用二甲苯透明和中性樹脂密封。最后，在光學顯微鏡下觀察和拍照。

2.4 油紅O 染色將剩余完整的肝臟用4% 多聚甲醛固定，然后OCT 包埋劑滴入組織。組織被完全覆蓋并迅速冷凍，用冷凍切片機切片，厚度為4 μm。將切好的冰凍切片放入切片架回溫10 min。配制油紅O 染色工作液，用濾紙過濾備用。加入適量染色洗滌液，覆蓋樣品20 s 后吸出。加入適量染色洗滌液覆蓋樣品20 s 后吸除染色洗滌液，將配制好的油紅O 染色工作液滴加于切片上染色20 min，去除工作液，將適量染色洗滌液滴加于切片上，靜置30 s，浸入蒸餾水中置于搖床洗滌20 s。用蘇木精染色液對細胞核復染，封片，在顯微鏡下觀察拍照。

2.5 免疫組化染色將石蠟切片后烘烤2 h，乙醇梯度脫水（乙醇濃度100%、100%、95%、90%、80%、70%），枸櫞酸鈉抗原修復液高壓修復10 min，使用3% H2O2去除內源性過氧化物酶，然后用山羊血清封閉30 min，滴加兔來源的nestin Ⅰ抗（1∶300）4 ℃孵育過夜。PBS 清洗后滴加Ⅱ抗。DAB 顯色后蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察、拍照。用ImageJ 軟件分析染色單位面積百分比。

2.6 Western blot使用全蛋白提取試劑盒將神經管在4 ℃裂解緩沖液中勻漿，在12 000 ×g離心5 min后取上清液進行Western blot。用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質通過SDS-PAGE 分離，轉移到PVDF 膜。用5% 脫脂奶粉封閉1 h 后，分別用 抗Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、nestin（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗體孵育過夜，PBS 清洗后用HRP標記的Ⅱ抗孵育、化學發光，經ImageJ軟件統計分析每組蛋白的相對表達量。

2.7 透射電鏡觀察超微結構將分離的胚胎神經管迅速置于戊二醛中2 h后用PBS清洗3次。用四氧化鋨固定，脫水，包埋，HITACHI-7650 透射電子顯微鏡觀察切片胚胎神經管的發育和線粒體的超微結構。

2.8 線粒體膜電位（mitochondrial membrane poten?tial，MMP）的檢測按照線粒體提取試劑盒說明書進行，首先稱取100 mg 的新鮮胚胎神經管組織，PBS沖洗后用濾紙吸干，用剪刀剪碎，加入線粒體分離試劑A，在冰浴上進行勻漿后收集勻漿液。在1 000 ×g，4 ℃離心5 min。收集上清在11 000 ×g，4 ℃再次離心10 min。小心去除上清，沉淀即為分離得到的線粒體，收集沉淀立即用于MMP的檢測。

MMP 的檢測參照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）說明書進行，步驟如下：（1）配制JC-1 染色工作液，取50 μL 200×的JC-1 加入8 mL 超純水稀釋后充分混勻，然后再加入2 mL 5×的JC-1 染色緩沖液，混勻后即為JC-1染色工作液；（2）把配制好的JC-1染色工作液再用1×的JC-1 染色緩沖液稀釋5 倍。取0.9 mL 5 倍稀釋的JC-1 染色工作液加入到0.1 mL 之前純化的線粒體；（3）用多功能酶標儀進行檢測，結果以相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）表示。同時將加了工作液的純化線粒體滴加在載玻片上，應用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，拍照。

2.9 ATP 含量檢測按照ATP 檢測試劑盒（碧云天）說明書，步驟如下：（1）每20 mg 神經管組織加入約200 μL 裂解液，充分勻漿確保組織被完全裂解。裂解后4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清，用于后續的測定。（2）配制ATP 檢測工作液：取50 μL ATP 檢測試劑加入5 mL ATP 檢測試劑稀釋液配制成5 mL ATP 檢測工作液；（3）ATP 濃度的測定：加100 μL ATP 檢測工作液到檢測孔內，室溫放置5 min，在檢測孔內加上20 μL 樣品或標準品，迅速混勻，用多功能酶標儀測定相對數值，繪制標準曲線，并根據標準曲線計算出每組ATP的含量。

3 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析。定量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，兩組間均數比較首先進行正態性檢驗，滿足正態性則進行兩樣本t檢驗，若不滿足則進行秩和檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 成功構建小鼠肥胖模型

ND 組及HFD 組小鼠的體重增量分別為（4.47±0.65）g和（7.02±0.51）g，HFD組較ND組增重明顯，見圖1A；ND 組及HFD 組小鼠血脂中的TC 分別為（2.9±0.32）mmol/L 和（4.74±0.17）mmol/L，TG 分別為（0.25±0.1）mmol/L 和（0.72±0.26）mmol/L，HDLC 分 別 為（1.51±0.35） mmol/L 和（2.76±0.27）mmol/L，LDL 分別為（0.31±0.1）mmol/L 和（1.16±0.18）mmol/L，見圖1B；肝臟HE 和油紅O 染色結果顯示，ND 組小鼠肝小葉結構規則，肝細胞排列有序，大小均勻，以中心靜脈為中心呈放射狀排列；而HFD組小鼠肝細胞排列無序，細胞核轉移由于脂肪空泡的影響，肝細胞腫脹，顯示彌漫性脂肪變性，胞漿豐富大小不同的圓形的脂質滴，見圖1C、D。

Figure 1.Identification of obesity mouse model induced by high-fat diet（NFD）.A：body weight；B：blood lipid level；C：liver HE staining of maternal mice in normal diet（ND）and HFD groups（×200）；D：liver oil red O staining of maternal mice in ND and HFD groups（×200）.Mean±SD. n=8.*P<0.05，**P<0.01 vs ND group.圖1 高脂飲食誘導肥胖小鼠模型的鑒定

2 高脂飲食引起的肥胖引起子代神經管發育不良

胚胎神經管HE 染色結果顯示，兩組神經管細胞排列緊密，無核溶解、固縮現象，形態結構無明顯差異，見圖2A。免疫組化檢測兩組nestin 蛋白表達水平分別為（16.17±1.28）%和（22.19±1.27）%，HFD組較ND 組顯著升高，見圖2B，Western blot 檢測ND組及HFD 組nestin 的相對蛋白表達水平分別為（0.26±0.03）和（0.62±0.08），見圖2C。透射電鏡顯示兩組胚胎神經管的突觸前膜和后膜清晰可見，但HFD 組突觸間隙消失，有一定程度的融合，神經管的發展有明顯的缺陷（紅色箭頭所示，見圖3A）。

Figure 2.High-fat diet（HFD）-induced obesity caused neural tube dysplasia in offspring.A：HE staining of embryonic neural tubes in normal diet（ND）and HFD groups（×400）；B：the protein expression levels of nestin in embryonic neural tubes were de?tected by immunohistochemistry staining（×400）；C：the protein expression levels of nestin in embryonic neural tubes were detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs ND group.圖2 高脂飲食引起的肥胖導致子代神經管發育不良

3 高脂飲食誘導的肥胖導致后代線粒體結構紊亂，神經管細胞凋亡增多

透射電鏡觀察線粒體超微結構發現ND 組神經管線粒體呈卵圓形，線粒體嵴正常。而HFD 組神經管線粒體水腫，可見大量空泡，線粒體嵴破裂、模糊甚至消失，變形、增大，結構明顯異常（紅色箭頭所示，見圖3B）。Western blot結果表明ND組與HFD組小鼠胚胎神經管的Bax/Bcl-2 蛋白表達比值分別為（0.48±0.04）和（2.35±0.16），見圖3C，表明高脂飲食引起的母體肥胖可導致子代神經管凋亡細胞增加。

4 高脂飲食引起的肥胖導致后代神經管線粒體功能紊亂

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，與ND 組相比，HFD 組線粒體膜電位降低，紅色熒光（JC-1 聚合物）減弱，綠色熒光（JC-1 單體）增強。熒光酶標儀檢測ND 組及HFD 組的紅色熒光值分別為（44575±1543）和（30450±1230），ATP含量分別為（0.13±0.02）μmol/L 和（0.05±0.02）μmol/L，HFD 組均較ND 組降低，見圖4。以上結果表明，高脂飲食引起的肥胖可引起子代神經管線粒體功能紊亂。

Figure 3.High-fat diet（HFD）-induced obesity led to the disorder of mitochondrial structure and the increase of cell apoptosis in neu?ral tube of offspring.A：observation of embryonic neural tube development by electron microscopy（×8 000）；B：ultrami?croscopic observation of embryonic mitochondrial structure by electron microscopy（×8 000）；C：the protein levels of Bax and Bcl-2 in embryonic neural tube were detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs normal diet（ND）group.圖3 高脂飲食誘導的肥胖引起子代神經管線粒體結構紊亂，細胞凋亡增加

討 論

肥胖已經成為一個嚴重的公共健康問題［17］，孕婦超重和肥胖的發生率逐年增加［18］。研究發現，肥胖母親與后代患NTDs 的風險之間存在劑量-反應關系，后代患NTDs的OR 值隨BMI的增加而迅速增加，尤其是當BMI≥30 kg/m2時［19］。此外，一項薈萃分析發現，母親肥胖與后代神經管缺陷風險增加顯著相關［20］。也有研究發現在神經管閉合過程中ATP 含量顯著增加，說明在神經管發育過程中需要更多的能量來保證神經細胞的正常分化和發育［21］。這些研究表明，神經系統的發育容易受到母體能量代謝的影響。然而，母體肥胖導致子代神經管缺陷發生率增加的機制尚不清楚。

Figure 4.High-fat diet（HFD）-induced obesity led to the functional disorder of mitochondria in neural tubes of offspring.A：the mito?chondrial membrane potential of embryonic neural tubes was observed by confocal microscopy（×200），and the red-green fluorescence intensity of JC-1-stained embryonic neural tubes was detected by multifunctional microplate reader；B：the ATP content in embryonic neural tubes was determined by multifunctional microplate reader.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs normal diet（ND）group.圖4 高脂飲食引起的肥胖導致子代神經管線粒體功能紊亂

本研究首先通過12 周的高脂肪飲食構建肥胖小鼠模型，發現HFD 組體重、血脂明顯高于ND 組，肝臟HE 及油紅O 染色也顯示大量的脂肪堆積在肝細胞，表明高脂肪飲食成功誘導小鼠肥胖模型。接下來，將滿足上述條件的雌鼠與成年雄鼠合籠，使其妊娠。在妊娠8.5～10.5 d是小鼠胚胎神經管發育的關鍵時期，在妊娠14.5 d神經管已充分發育，因此我們選擇E14.5 d神經管為研究樣本［22］。nestin被廣泛認為是神經干細胞的標記物。它在神經胚形成時開始表達，隨著神經干細胞的逐漸遷移和分化，nestin的表達逐漸減少，并在神經干細胞分化后停止表達。因此我們在E14.5 d分離神經管，進行HE染色、免疫組織化學染色、Western blot 發現nestin 在HFD 組的表達高于ND 組，提示子代神經管發育異常。同時，我們利用透射電鏡觀察超微結構，發現兩組神經管的突觸前膜和后膜清晰可見，但HFD 組突觸間隙消失，有一定程度的融合。我們還發現HFD 組神經管線粒體結構紊亂，出現線粒體水腫，出現大量空泡，線粒體嵴斷裂、模糊甚至消失，這與課題組之前的研究結果一致［23］。

眾所周知，形態和結構的改變往往伴隨著功能的改變，因此我們進一步檢測了兩組神經管的線粒體功能。線粒體膜電位的維持對線粒體功能至關重要，因此線粒體膜電位水平被認為是線粒體的健康指標［24］。JC-1 是一種理想的熒光探針，廣泛用于檢測線粒體膜電位［25］。當線粒體膜電位較高時，JC-1在線粒體基質中聚集形成聚合物，可產生紅色熒光。相反，當膜電位較低時，JC-1 以單體形式存在，可發出綠色熒光。因此，可以通過熒光的顏色變化來檢測線粒體膜電位［26］。本研究中HFD組線粒體膜電位明顯低于ND 組。此外，我們還測量了神經管中細胞的ATP 含量，因為充足的ATP 供應對神經細胞的發育和分化至關重要。我們發現HFD組ATP含量明顯低于ND 組，這與我們觀察的線粒體膜電位結果一致，反映出肥胖小鼠胚胎神經管線粒體功能受損。

一般來說，線粒體膜電位的降低是凋亡的特異性早期指標之一［27］。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，在機體發育過程中普遍存在，在調節胚胎發育、細胞更新、維持細胞數量等方面發揮著重要作用［28］。細胞凋亡發生在神經管形成到神經系統發育的過程中。在這一過程中，細胞增殖與凋亡之間存在著動態平衡，保證了神經管的正常分化和發育。當這種不平衡被破壞時，就會導致神經管缺陷［29-30］。因此，當線粒體膜電位降低時，我們進一步檢測凋亡相關標志物的表達。Bcl-2 家族在細胞凋亡線粒體通路中起重要作用，其中Bcl-2是主要的抗凋亡因子，Bcl-2 家族中的Bax 是促凋亡蛋白［31］，因此Bax/ Bcl-2 值是評價多種因素介導的細胞凋亡的重要指標［32］。Western blot 結果顯示，與ND 組相比，HFD 組Bax 升高，Bcl-2降低，Bax/Bcl-2比值升高，說明HFD 組神經管細胞凋亡增加。結合前期nestin檢測結果，我們可以得出母體肥胖時胚胎神經管發育不良，細胞凋亡增多，打破了正常發育的平衡。

綜上所述，高脂飲食誘導的母體肥胖影響了子代神經管線粒體的結構和功能，進而激活線粒體凋亡通路，導致細胞凋亡增加，最終影響子代神經管的發育。然而，母體肥胖引起的胚胎神經管發育不良是由母體胰島素還是瘦素引起，尚不清楚，需要進一步研究。本研究為神經管缺損的發病機制研究提供了理論依據，同時也提示孕婦應建立健康的生活和飲食習慣，保持能量平衡，改善母體肥胖對后代神經發育的不良影響。