北京棒桿菌單體天冬氨酸激酶T379N/A380C/T65I/D173G突變體酶學性質表征及工程菌構建

王亞南，劉曉婷，樊占青，王哲人，高 欣，閔偉紅

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

天冬氨酸族氨基酸被廣泛應用于食品、飼料、化妝品、藥物等[1-2]，目前主要采用低成本、對環境友好的微生物發酵法生產[3-4]。其代謝途徑受天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）、高絲氨酸脫氫酶[5]、高絲氨酸酰基轉移酶[6]和高絲氨酸巰基酶[7]調節，其中AK是影響碳流走向的首個關鍵限速調控點，將ATP的磷酸基團轉移到天冬氨酸（Asp），并生成天冬氨酰-4-磷酸[8]，最終轉化為賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）和甲硫氨酸（Met），因此AK對天冬氨酸家族氨基酸產物的積累具有至關重要的影響。為了優化代謝途徑過量積累天冬氨酸族氨基酸，解除變構抑制和提高酶的催化活性成為研究關注點[9-12]。

在已報道的生物體中，AK的晶體結構主要為同型和異型寡聚體[13]，存在形式主要有單功能AK（AKI、AKII和AKIII）和雙功能AK-HSDH（I和II）[14]。如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的AK是一種高寡聚體，AKI受Lys和Met的抑制，AKII和AKIII只受Lys抑制[15-17]；在大腸桿菌（Escherichia coli）中的AKIII是同源二聚體，受Lys抑制[18]；而在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）中的AKII受Lys和Thr協同抑制[19]，是由α和β亞基組成的異源四聚體（α2β2），α亞基在N末端包含一個催化結構域，在C末端包含一個調節結構域[20]。以上報道的AK均以多聚體形式存在，然而本實驗室發現北京棒桿菌中AK（C. pekinenseaspartate kinase，CpAK）呈單體狀態[21]，與谷氨酸棒桿菌中AK（C. glutamicumaspartate kinase，CgAK）具有98.78%的同源性，可基于CgAK的序列構建CpAK的模型。

與CgAK相同，CpAK含有調節結構域和催化結構域，包含Thr、Lys、ATP、底物Asp 4個關鍵配體。目前，多數研究對調節結構域的抑制劑Lys結合位點進行定點突變[22-25]，對催化結構域ATP、底物Asp結合位點的改造較少。本研究在各個配體周圍對4個關鍵殘基位點同時進行定點突變，篩選出有效解除反饋抑制的酶活力提高突變體T379N/A380C/T65I/D173G，通過無縫克隆技術構建北京棒桿菌工程菌，旨在為構建高產天冬氨酸族氨基酸菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質粒、菌株與試劑

大腸桿菌重組質粒（pET-28a-AK）、大腸桿菌感受態DH5α和BL21（DE3）、北京棒桿菌AS1.299均由實驗室提供；表達載體pEC-XK99E 湖南豐暉生物科技有限公司。

質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒、Taq酶、核酸電泳Marker、DpnI消化酶 TaRaKa（大連）有限公司；丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；非變性鎳柱柱料 美國GE公司；限制性核酸內切酶EcoR I、BamH I、引物合成、測序由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；無縫克隆試劑盒MonCloneTMHi-Fusion Cloning Mix V2莫納（蘇州）生物科技有限公司。

1.1.2 培養基

LB液體培養基：1%蛋白胨，0.5%酵母浸粉，1% NaCl；LB固體培養基另加2%瓊脂。

北京棒桿菌感受態培養基：在LB液體培養基上另加0.3%甘氨酸，0.1%吐溫80。

北京棒桿菌電轉化恢復培養基：0.25%酵母浸提物，0.5%蛋白胨，0.5% NaCl，9.1%D-山梨醇，18.5%腦心浸液，固體培養基另加入2%瓊脂。

種子培養基：2.5%葡萄糖，2%玉米漿，0.1% KH2PO4，0.5% MgSO4，0.125%尿素。

發酵培養基：10%葡萄糖，2%玉米漿，2% (NH4)2SO4，0.1% KH2PO4，0.05% MgSO4，0.001% MnSO4，0.001% FeSO4，0.000 1% VB1，0.000 6% VB6，0.02% VB12，0.000 01%生物素。

以上培養基均用2 mol/L NaOH溶液調pH值為7.0。

1.2 儀器與設備

梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 德國Eppendorf AG公司；DYCP-31DN核酸電泳儀 北京市六一儀器廠；Spectra Max 190酶標儀美國Molecular Devices公司；超聲破碎儀 寧波新芝生物科技有限公司；Z36HK低溫高速離心機 德國Hermle公司；蛋白印記轉膜儀 美國Bio-Rad公司；SE260蛋白電泳儀、瓊脂糖凝膠成像儀 美國GE公司；L-8900高速氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 突變株的構建

PCR擴增AK基因：運用Primer 5.0軟件設計引物，上游引物為5’-GGTCGTGGTGGTTCTNNNACCACTGCAG TTG-3’，下游引物為5’-CGCAACTGCAGTGGTNNNAG AACCACCACG-3’，NNN表示飽和突變，合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。從重組大腸桿菌中提取pET-28a-AK質粒并以其為模板，在引物作用下，經94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，54～58 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min（以上3 步循環18 次）；72 ℃保溫10 min完成突變PCR，并進行1%瓊脂糖核酸電泳驗證。將驗證成功的PCR產物用DpnI酶37 ℃金屬浴消化2 h。轉入大腸桿菌宿主：將2 μL消化后的PCR產物轉入冰上預冷30 min的BL21感受態細胞，冰浴5 min，42 ℃熱激90 s，再冰上孵育2 min，加入不含卡那霉素的LB培養基900 μL，于37 ℃、170 r/min培養1.5 h，9 000 r/min離心2 min棄上清液800 μL，吹懸菌體后涂布于LB固體平板（含終質量濃度為50 mg/L卡那霉素）上，37 ℃過夜培養。

高通量篩選：將單克隆菌株從抗性平板轉接到96 孔板中過夜培養，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，在28 ℃、130 r/min培養12 h誘導蛋白表達。3 500 r/min離心45 min后棄上清液，加入100 μL磷酸鹽緩沖液反復吹打菌體，凍融破碎后測定其酶活性，高通量篩選出高酶活力的突變株，方法參考文獻[26]。以高酶活力菌株擴大培養的菌液為模板，在克隆引物作用下進行菌液PCR擴增，反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環30 次；72 ℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳進行菌液PCR產物驗證，并進行基因測序以證明突變株構建成功。

1.3.2 蛋白表達與純化

以2%接種量將野生型（wild type，WT）和突變體菌株在100 mL LB液體培養基中培養，當OD600nm達到0.7時，添加IPTG（終濃度1 mmol/L）100 μL，分別在25 ℃和28 ℃培養10 h誘導蛋白表達。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液并加入預冷的磷酸鹽緩沖液重懸菌體，菌體經超聲破碎并離心后，上清液經0.22 μm濾膜處理后即為AK粗酶液，將其通過鎳柱分離純化，經不同濃度咪唑溶液梯度洗脫去除雜蛋白后得到AK純化液。所得樣液變性后用SDS-PAGE和Western Blot驗證，具體方法參考文獻[12]。

1.3.3 酶動力學測定

用10 個不同濃度（0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L）的L-Asp底物進行酶活力測定，并在520 nm波長處測吸光度，反應體系及條件參考文獻[24]，計算比活力。通過Origin 8.5軟件與Hill方程V=VmaxSn/（Kn+Sn）進行非線性擬合。反應速率V表示1 min內1 mg酶的催化能力，Vmax表示酶完全被底物飽和時的最大反應速率。

1.3.4 AK酶學性質分析

最適溫度：底物濃度為3 mmol/L，反應體系與酶活力測定相同，在不同溫度（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50 ℃）條件下反應30 min，最高酶活力定義為100%。

最適pH值：反應體系同上，加入不同pH值的Tris-HCl緩沖液（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0），最高酶活力定義為100%。

穩定性：在得出的最適溫度和最適pH值條件下，其余反應體系不變，反應30 min后測定酶活力，0 h酶活力定義為100%，之后每隔1 h測定酶活力，共測10 次。

抑制劑對酶活力的影響：向反應體系中加入不同的抑制劑（Thr、Lys、Met、Lys+Thr、Lys+Met、Thr+Met或Thr+Lys+Met），每種或多種抑制劑的最終濃度分別為0.2、1、5、10 mmol/L，以檢測抑制劑對AK活力的影響，添加水的對照組相對酶活力定義為100%。

1.3.5 工程菌構建

獲得目的基因片段：提取WT和突變株T379N/A380C/T65I/D173G的質粒為模板，在克隆引物作用下經94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min（以上3 步循環18 次）；72 ℃保溫10 min完成PCR擴增，并進行1%瓊脂糖核酸電泳，再進行膠回收獲得大量的目的基因。

線性化載體pEC-XK99E：提取質粒獲得表達載體pEC-XK99E，線性化載體的反應體系為EcoR I酶2 μL、BamH I酶2 μL、pEC-XK99E質粒25 μL，將線性化載體進行1%瓊脂糖核酸電泳和膠回收。

無縫克隆連接：將膠回收的目的基因片段和線性化載體按以下體系進行無縫克隆連接：線性化載體1 μL、目的基因片段2 μL、Hi-Fusion Cloning Mix V2 2.5 μL，連接成功后轉入大腸桿菌DH5α感受態，操作方法同于轉入大腸桿菌BL21感受態。

電轉化入北京棒桿菌：將提取測序成功菌株的質粒5 μL加入北京棒桿菌感受態細胞，在冰上預冷10 min后全部轉入電轉杯，用20 kV電擊5 ms，加入LBHIS培養基洗滌后，30 ℃、100 r/min復蘇2 h，若菌濃度過低可延長復蘇時間。將復蘇的菌體于8 000 r/min離心2 min后棄去800 μL培養基上清液，剩余200 μL重懸后涂布于北京棒桿菌電轉化恢復固體培養基上（含卡那霉素），30 ℃倒置培養36 h，挑菌測序。

1.3.6 發酵及氨基酸含量測定

對WT和構建的T379N/A380C/T65I/D173G菌株進行48 h菌株發酵培養，每6 h取樣，取氨基酸含量較穩定的第30小時發酵液進行氨基酸含量測定[27-29]。取2 g樣品于20 mL水解管中，加入16 mL 6 mol/L鹽酸溶液，真空脫氣30 min，充氮封管，110 ℃水解22～24 h，取出冷卻開管，用去離子水無損轉移到50 mL容量瓶并定容。準確取1 mL水解液于小瓶中，于真空中脫酸抽干，加1 mL水再抽干，再加1 mL水再抽干備用。上機前準確加入1 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液，充分溶解，用0.22 μm的水相膜濾膜過濾后用高速氨基酸分析儀進行分析。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 關鍵突變位點的確定

本實驗室利用SWISS-MODEL構建單體AK的三維結構，使用ATP Bind server和COACH-D預測配體的結合位點，采用Auto Dock對配體進行對接，成功構建的單體AK模型見圖1A[21]。利用Clustal X軟件對多個不同生物體內的AK進行同源序列比對，用ESPript進行修飾比對結果，紅色部分表示高同源性保守位點（圖1B）。運用Discovery Studio 4.0軟件對AK模型進行分析，選取了不同配體周圍的4個位點進行定點突變：抑制劑Lys的結合位點Thr379和Aln380，Thr379與抑制劑Lys的羧基由氫鍵緊密連接；Ala380位點與Thr379緊密相連，且與抑制劑Lys通過水分子連接（圖1C）。Thr65通過氫鍵與底物Asp相連是關鍵的結合位點（圖1D）。文獻報道，甲烷球菌AK（Methanococcus jannaschiiAK，MjAK）（PDB：2hmf）的Asp211[29]和大腸桿菌（PDB：2j0w）的Asp202位點為催化活性中心位點[18]，利用SPDB軟件對幾種模型進行空間結構比對，發現都對應CpAK中Asp173位點，其位于底物Asp和ATP中間（圖1E）。

圖1 突變位點的確定Fig. 1 Determination of mutation sites

2.2 突變體構建

定點突變PCR擴增產物用1%瓊脂糖核酸電泳進行驗證，結果如圖2A所示，在7 000 bp左右有單一明亮條帶，證明目的基因擴增成功。PCR產物經DpnI酶消化作用后用熱激法轉入到大腸桿菌感受態BL21細胞中，采用高通量篩選方法篩選出高酶活力突變體，并進行菌液PCR，驗證結果如圖2B所示，在1 000～2 000 bp之間有明顯條帶，與CpAK（1 317 bp）長度一致，證明目的基因AK已成功導入大腸桿菌菌株。對該菌株進行測序，測序結果與AK原序列比對見圖2C，Thr379、Ala380、Thr65、Asp173位點分別由Thr突變為天冬酰胺（Asn）、由Ala突變為半胱氨酸（Cys）、由Thr突變為異亮氨酸（Ile）、由Asp突變為甘氨酸（Gly），成功構建了T379N/A380C/T65I/D173G突變體。

圖2 突變體T379N/A380C/T65I/D173G的構建Fig. 2 Construction of mutant T379N/A380C/T65I/D173G

2.3 蛋白表達與純化

將誘導表達的WT和突變體菌株經破碎、離心、過膜后進行非變性鎳柱純化，得到AK粗酶液和AK純化液，分別變性后經SDS-PAGE和Western Blot驗證，結果見圖3，AK純化液在48 kDa左右處均有單一條帶，表明AK蛋白成功表達。

圖3 SDS-PAGE（A）及Western Blot（B）結果Fig. 3 Results of SDS-PAGE (A) and Western Blot (B)

2.4 反應動力學分析

圖4 WT和T379N/A380C/T65I/D173G的動力學分析Fig. 4 Kinetic analysis of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

表1 WT及T379N/A380C/T65I/D173G動力學參數Table 1 Kinetic parameters of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

通過軟件Origin 8.5中的Hill方程V=VmaxSn/（Kn+Sn）進行非線性擬合得到Vmax、n和Km，WT和T379N/A380C/T65I/D173G的動力學參數分析如圖4和表1所示。T379N/A380C/T65I/D173G的Vmax為267.67 U/（mg·min），WT的Vmax為3.53 U/（mg·min），提高到75.83 倍。Km值表示當反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度，突變后AK的Km值由4.11 mmol/L降低至1.34 mmol/L，表明突變后與底物親和力增強。n值為Hill方程的希爾系數，代表協同性，其中n＜1表示負協同反應；n=1表示非協同反應：n＞1表示正協同反應，酶對配體的親和力增大。AK的n值為1.71，突變體T379N/A380C/T65I/D173G的n值為1.07，n值降低，表明突變后AK的正協同性降低。

2.5 酶學性質表征

2.5.1 溫度對AK活力的影響

如圖5A所示，WT AK最適溫度為25 ℃，突變后T379N/A380C/T65I/D173G AK的最適溫度為30 ℃，最適溫度提高5 ℃。在20～45 ℃溫度范圍內，突變體相對酶活力仍保持在60%以上，而且當溫度低于20 ℃或高于26 ℃時，突變后的酶活力均高于WT，表明突變改善了酶的耐受溫度性能，這對后期氨基酸發酵生產有益。

圖5 WT和T379N/A380C/T65I/D173G的酶學性質表征Fig. 5 Enzymatic properties of WT and T379N/A380C/T65I/D173G

2.5.2 pH值對AK活力的影響

由圖5B可知，WT和T379N/A380C/T65I/D173G的AK最適pH值均為8.0，然而，突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK在pH 6～10條件下的相對酶活力均高于WT。

2.5.3 AK穩定性分析

分別在WT和T379N/A380C/T65I/D173G AK的最適溫度和最適pH值條件下，測定酶穩定性，結果如圖5C所示。計算得到WT AK的半衰期為4.24 h，而T379N/A380C/T65I/D173G AK的半衰期為3.56 h，較WT AK縮短了0.68 h，突變導致酶的穩定性減弱。在前2 h和6 h后，突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK相對酶活力高于WT，10 h時突變體酶活力仍維持在20%左右，顯著高于此時的WT。

2.5.4 底物抑制劑對AK活力的影響

根據表2可知，WT AK受Lys、Thr和Met抑制，抑制作用與抑制劑濃度呈正相關。單個抑制劑Lys濃度為10 mmol/L條件下，抑制率最高為56.22%；由于Lys和Thr兩種抑制劑的共同作用，抑制效果最顯著達到69.68%，WT AK的相對酶活力為30.32%。CpAK的抑制機制與CgAK相似，都是通過Thr和Lys的協同反饋抑制。當3種抑制劑共同作用時，最大抑制率為54.56%。突變體T379N/A380C/T65I/D173G AK在大多數抑制劑濃度下都有抑制作用減弱甚至被明顯激活的趨勢：在不同濃度Lys、Lys+Thr存在時都起到激活作用，尤其是在5、10 mmol/L的底物抑制劑Lys+Thr+Met條件下，相對酶活力分別達到114.30%和119.42%，說明突變體有效地解除反饋抑制，并且激活作用以劑量依賴性的方式增強。

表2 底物抑制劑濃度對WT和T379N/A380C/T65I/D173G相對酶活力的影響Table 2 Effects of different concentrations of substrate inhibitors on the relative activity of WT and T379N/A380C/T65I/D173G%

2.6 工程菌構建及發酵測氨基酸含量

提取WT和構建成功的突變體T379N/A380C/T65I/D173G的質粒進行PCR擴增，產物進行1%瓊脂糖核酸電泳驗證，結果如圖6A所示，1 000～2 000 bp之間有明顯條帶，與目的基因（1 317 bp）長度一致。線性化載體pEC-XK99E的大小為7 018 bp，與圖6B條帶位置一致。將膠回收的目的基因片段和線性化載體無縫克隆連接轉入大腸桿菌感受態，然后電轉化法轉入北京棒桿菌中，質粒的核酸電泳驗證結果如圖6C所示，并測序證明WT和突變體T379N/A380C/T65I/D173G北京棒桿菌構建成功。

圖6 工程菌構建的核酸電泳驗證Fig. 6 Nucleic acid electrophoresis verification of constructed engineering strains

取30 h的發酵液進行氨基酸含量測定，結果如表3所示。相較于WT，下游氨基酸產量提高：Lys積累量由0.59 g/L提升至1.08 g/L，提高了83.05%；Thr產量由1.09 g/L增加至1.41 g/L，增加了29.36%；Met產量由0.13 g/L提高到0.17 g/L，提高了30.77%，Asp產量由0.33 g/L下降至0.15 g/L，下降了54.54%。原因可能是AK的Lys結合位點、ATP結合位點及底物結合位點通過突變，有效地解除了Thr和Lys和協同反饋抑制，提高了酶活性，使碳流量更多地進入天冬氨酸族氨基酸的合成途徑，產量得以提高，然而突變后促進Asp流向三羧酸循環，從而使Asp積累量降低。

表3 發酵液中氨基酸產量Table 3 Amino acid contents in fermentation broth g/L

3 結 論

對關鍵位點Thr379、Aln380、Thr65、Asp173同時進行定點突變，成功篩選出獲得酶活力顯著提高到75.83 倍的AK突變體T379N/A380C/T65I/D173G，其與底物Asp的親和力增強。酶學性質有利于菌株氨基酸發酵生產：最適反應溫度由25 ℃提升至30 ℃，耐熱性增強；最適pH值不變，酸堿耐受能力增強；半衰期由4.24 h縮短至3.23 h，穩定性略微減弱；有效地解除抑制劑的反饋抑制作用。此外，成功構建了北京棒桿菌工程菌，Lys產量達到1.08 g/L，Thr產量達到1.41 g/L，Met產量達到0.17 g/L，為優化Asp代謝途徑和構建高產天冬氨酸族氨基酸提供參考。