黃皮轉錄組測序及抗氧化相關基因的挖掘

劉照宇，劉新婷，白新宇，李 雯，曾教科

（海南大學園藝學院，海南 海口 570228）

黃皮（Clausena lansium(Lour.) Skeels），屬蕓香科黃皮屬，為原產于我國華南地區的特色水果，海南為主產區之一[1]。黃皮果實風味獨特，具有較高的營養價值，可鮮食、加工以及藥用，因而深得消費者喜愛[2-4]。黃皮前期的研究主要集中在種質資源和生理生化，包括采前品種的形態和理化性狀、物候期、抗性、種質資源和育種等方面[5-7]，采后的營養物質和生物活性功能[2,8-9]，以及采后保鮮處理技術等[10-12]。而對黃皮果實分子層面的研究甚少，目前主要集中在一些基因的克隆及分子標記等方面[7,13-15]。

黃皮果實屬于非呼吸躍變型，但果實在采后貯運過程中，生理代謝活動旺盛，導致果實成熟與衰老加速，品質劣變迅速。且黃皮果肉柔軟多汁，果皮較薄，采后1～2 d即發生褐變，商品性下降。黃皮果實采后褐變主要是由多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）引起的酶促褐變，不同采后處理技術措施如低溫[16]、熱處理[17]和殼聚糖浸泡[18]等均可以在一定程度上提高黃皮果實超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等抗氧化酶活性，從而抑制PPO活性，減緩褐變的發生。本實驗前期的研究結果也顯示，采后熱激（heat treatment，HT）和程序降溫（low temperature conditioning，LTC）處理可以有效提高抗氧化酶SOD、PAL和POD等活性，從而抑制黃皮果實褐變，維持果實品質[11-12]。但是，對黃皮抗氧化酶編碼基因的研究報道較少，研究進展緩慢，因此，有必要通過轉錄組學技術挖掘黃皮果實抗氧化酶編碼基因。

轉錄組學可用于在mRNA水平上鑒定差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），從而解釋園藝學科中一些理論和現象，果實采后成熟衰老過程中基因的變化可以通過轉錄組學分析進行研究。如Liu Xia等[19]利用轉錄組學研究了鮮棗果實采后表皮凹陷，篩選出1 210 個DEGs響應表皮凹陷，這些基因主要參與了碳水化合物代謝和苯丙烷途徑等。Terol等[20]通過轉錄組學研究發現MADS-box轉錄因子參與調控柑橘果實早熟。Li Xin等[21]通過轉錄組學揭示了火龍果采后抗氧化機制的關鍵基因。而在黃皮果實轉錄組研究中，陸育生等[7]報道了利用黃皮轉錄組進行SSR挖掘和密碼子偏好性分析，但對黃皮果實采后品質和抗氧化相關的轉錄組研究鮮見報道。

本實驗采用轉錄組測序技術，對HT（50 ℃/30 s）、LTC（8 ℃/4 d）和對照（CK）（3 ℃）處理后3 ℃貯藏至第6天的黃皮果實進行測序，擬從轉錄組水平分析黃皮果實在不同處理技術下基因的表達差異，進而對DEGs進行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，同時篩選出抗氧化相關的DEGs，旨在為今后黃皮果實褐變的調控研究和品質維持提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃皮果實（“大雞心”品種）采自海南省海口市永興鎮黃皮果園，在商業采收期采收，挑選大小、色澤、形狀一致，無機械損傷及病蟲害的果實，立即運回實驗室進行處理。

氫氧化鈉、酚酞、95%乙醇溶液、碳酸氫鈉、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創木酚、核黃素、30%過氧化氫溶液、甲硫氨酸、氮藍四唑、EDTA-Na2、福林-酚試劑、碳酸鈉、沒食子酸、DPPH、無水甲醇西隴化工股份有限公司。所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

H1850R臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；2100生物分析儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

本實驗共分為3個處理：1）CK：果實直接低溫3 ℃貯藏；2）HT：50 ℃熱水浸泡30 s后轉到3 ℃貯藏；3）LTC：果實在8 ℃預貯4 d后轉到3 ℃貯藏。以采收當天為貯藏第0天，果實處理后貯藏至第8天，每2 d進行生理指標測定和凍樣，每個處理3個生物學重復，每個重復10 個果實；另每個處理單獨留取50 個果實，用于質量損失率及褐變指數的測定。

1.3.2 質量損失率與褐變指數測定

參考常文俊[12]的方法。

質量損失率采用稱質量法，使用與0 d比較的相對質量損失表示，用式（1）計算：

果實褐變指數采用分級法測定。每個處理隨機選取50 個黃皮果實進行褐變指數的觀察。將黃皮褐變程度分為5個等級：1級果：褐變面積＜1/4，2級果：1/4≤褐變面積＜1/2，3級果：1/2≤褐變面積＜3/4，4級果：褐變面積≥3/4，5級果為完全褐變的黃皮果實。

1.3.3 抗氧化酶與抗氧化活性測定

SOD活性使用氮藍四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）光還原法[22]進行測定。稱取2.0 g黃皮果肉，加入5 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.8）冰浴研磨至勻漿后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液待用。取0.1 mL上清液加入反應體系（50 mmol/L磷酸緩沖液，130 mmol/L甲硫氨酸溶液，750 μmol/L NBT溶液，100 μmol/L EDTA-Na2溶液，20 μmol/L核黃素溶液），搖勻，將試管置于4 000 lx白光條件下顯色反應30 min，每15 min轉管一次。以暗中對照管作空白（調零），在560 nm波長處測定反應液的吸光度，以每分鐘NBT光還原抑制50%為1個酶活力單位，SOD活性用U/g表示。每個處理3個生物學重復。

CAT活性的測定采用紫外分光光度法[23]。稱取2.0 g果肉，加入磷酸鈉緩沖液（pH 7.0，含0.05%聚乙烯吡咯烷酮）中研磨至勻漿后，12 000 r/min離心20 min，收集上清液待用。取0.1 mL提取液，加入2.9 mL 10 mmol/L的H2O2溶液，在240 nm波長處測定3 min內吸光度的變化，以磷酸鈉緩沖液為空白對照（調零），以每分鐘吸光度減少0.01為1個酶活力單位，CAT活性用U/g表示。每個處理3個生物學重復。

POD活性的測定參考愈創木酚法[24]。稱取2.0 g果肉，加入5 mL 0.1 mol/L乙酸緩沖液（pH 5.5，含1 mmol/L聚乙二醇、4%交聯聚乙烯吡咯烷酮和1% TritonX-100）冰浴研磨至勻漿后，在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液待用。取0.2 mL提取液，加入3 mL愈創木酚和0.2 mL H2O2溶液，在470 nm波長處測定1 min內吸光度的變化，以蒸餾水代替提取液為空白對照（調零），以每分鐘變化0.01為1個酶活力單位，POD活性用U/g表示。每個處理3個生物學重復。

抗氧化活性使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定方法[25]。稱取2.0 g果肉，加入少量石英砂和5 mL 1%鹽酸-甲醇溶液冰浴研磨至勻漿，后定容至25 mL，4 ℃避光靜置20 min，收集上清液。取0.1 mL提取液，加入2.9 mL 10 μmol/L的DPPH溶液，避光靜置30 min，測定517 nm波長處的吸光度為As，以超純水代替提取液作為對照，測定吸光度Ac，以無水乙醇代替DPPH作為空白對照，測定吸光度為Ao，DPPH自由基清除率按式（3）計算：

1.3.4 RNA提取與文庫建立

根據褐變指數、抗氧化酶和抗氧化活性等結果分析，從貯藏第6天開始，HT和LTC處理促進抗氧化活性的提高。因此，選擇貯藏第0天（編號0 d）和第6天（編號CK-6 d、HT-6 d、LTC-6 d）的黃皮果實進行轉錄組測序，每個樣品3個生物學重復。采用RNA prep Pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取果實RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop微量紫外分光光度計和2100生物分析儀檢測RNA樣品的濃度、純度和完整性。樣品檢測合格后，由廣州賽哲生物科技股份有限公司進行cDNA文庫構建，并對構建好的文庫用Illumina HiSeqTM進行轉錄組測序。

1.3.5 轉錄組測序數據分析

1.3.5.1 序列組裝與功能注釋

使用Trinity 2.2.0對所得過濾后的轉錄組reads數據進行拼接為contigs，將contigs連接得到scaffold，篩選掉含N片段得到Unigene庫。使用BLASTX將所有組裝的Unigene序列與Nr（http://www.ncbi.nlm.nih.gov，NCBI non-redundant protein sequences）、Swiss-Prot protein database、KEGG（http://www.genome.jp/kegg）、直系同源群集（Clusters of Orthologous Group，COG）/KOG（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）等數據庫中已知序列進行比對（E-value＜10-5），得到具有較高相似性的蛋白序列，從而得到Unigene對應的蛋白功能注釋信息。

1.3.5.2 DEGs篩選及聚類分析

使用RSEM（RNA-Seq by Expectation-Maximization）軟件做定量分析，基因表達量使用FPKM（fragments per kilobase of exon per million mappedfragments）表示[26]。然后使用edgeR軟件（v3.14.0）篩選DEGs，篩選條件為錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05且|log2FC|＞1。其中FDR通過對差異顯著性P值進行校正得到；差異倍數（fold change，FC）表示所對比的樣品間FPKM比值，log2FC為正值表明基因上調，反之則為下調。

聚類分析用于判斷DEGs在不同處理條件下的表達模式。以不同處理DEGs的FPKM值為表達水平，做層次聚類分析，不同顏色的區域代表不同的聚類分組信息，同組內的基因表達模式相近，可能具有相似的功能或參與相同的生物學過程。

1.3.5.3 GO富集分析和通路富集分析

根據Unigene的Nr注釋，使用BLAST2GO軟件獲取Unigene的GO信息，使用WEGO進行分類統計。通路顯著性富集分析以KEGG通路為單位，應用超幾何檢驗，找出DEGs相對于所有有注釋基因顯著富集的通路。以KEGG通路為單位，使用KOBAS進行通路富集分析。使用Pfam數據庫對序列進行對比，確定基因類型，若Pfam無法預測，則使用基因功能確定。

1.4 數據處理

利用Excel 2007和SPSS 16.0等軟件對實驗數據進行統計分析，采用ggplot2包及pheatmap包作圖。使用R語言進行相關性分析，并使用ggcorrplot作圖。

2 結果與分析

2.1 HT和LTC處理對黃皮果實質量損失與褐變的影響

由圖1可知，黃皮的質量損失率和褐變指數隨貯藏時間延長整體呈上升趨勢，LTC處理可以顯著降低黃皮貯藏期間的質量損失率，而HT處理與CK相比差異不顯著（圖1A）。與CK相比，LTC處理也可以顯著降低黃皮果實褐變指數，而HT處理的黃皮果實在貯藏第6天后才有顯著差異（圖1B），因此，LTC處理是一種有效的抑制黃皮果實失水和褐變的調控措施。這與枇杷[27]、梨[28]、桃[29]等其他水果上的研究結果基本一致，LTC處理可有效減少果實采后失水，延緩褐變，從而延長貯藏壽命。

圖1 HT和LTC處理對黃皮果實質量損失（A）與褐變（B）的影響Fig. 1 Effects of HT and LTC treatment on mass loss (A) and browning (B) of wampee fruit

2.2 HT和LTC處理對黃皮果實抗氧化酶和抗氧化活性的影響

研究表明，黃皮果實采后衰老主要由褐變引起，而褐變主要由酚類物質的氧化導致[12]，因此，通過采后處理提高抗氧化能力（抑制酚類氧化）是一種有效延緩黃皮果實褐變的措施。由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，黃皮果實抗氧化酶活性均有不同程度的升高。CK組果實SOD和POD活性在貯藏第6天達到峰值，之后開始下降，至貯藏第8天時，明顯低于HT和LTC處理組果實。CK組果實CAT活性和DPPH自由基清除率則在貯藏第4天達到峰值，至貯藏第6天開始，顯著低于HT和LTC處理組果實。說明HT和LTC處理可顯著推遲抗氧化酶和抗氧化活性高峰的出現，維持黃皮果實貯藏中后期較高的抗氧化性能，從而延緩褐變的進程，這與周開兵[17]和常文俊[11]等的研究結果類似，HT或LTC處理可以提高黃皮果實抗氧化酶活性，增強自由基清除能力，從而延長黃皮貯藏或貨架壽命。類似的結果也在黃瓜和荔枝上得到證實，Wang Bin等[30]研究表明，貯前冷馴化（類似LTC）處理，可有效增強黃瓜抗氧化酶活性和基因表達，并且抗氧化酶及基因的變化在被誘導激活前有一個轉變點，表明足夠有效的抗氧化酶是低溫貯藏所必需。Zhang Zhengke等[31]研究也發現，蘋果多酚處理顯著推遲荔枝果實SOD和POD活性高峰的出現，從而延緩貯藏中期褐變的發生。

圖2 HT和LTC處理對黃皮果實抗氧化酶和抗氧化活性的影響Fig. 2 Effects of HT and LTC treatment on antioxidant enzyme activities and antioxidant activity in wampee fruit during storage

2.3 RNA樣品質量檢測

根據測序公司要求，對提取的RNA樣品進行濃度、純度和完整性檢測。如圖3所示，所有RNA樣品的OD260nm/OD280nm值在1.8～2.1之間，RNA完整值高于6.5，28S/18S核糖體亞基比率大于1。樣品檢測符合測序公司要求，可進行cDNA文庫構建及轉錄組測序。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳（A）和生物分析儀（B）檢測RNA樣品質量Fig. 3 Evaluation of RNA quality by agarose gel electrophoresis (A)and Agilent 2100 bioanalyzer (B)

2.4 轉錄組測序數據組裝及分析

黃皮轉錄組測序共獲得348 795 114 條原始reads，平均每個文庫29 066 260 條；篩選過濾后獲得345 649 476 條clean reads，占原始reads中99.1%，平均每個文庫28 804 123 條，每個文庫都產生超過3 G的clean bases，Q20的比例都超過96%，Q30都超過90%，說明測序質量較好。通過Trinity進行de novo組裝后，從12個文庫中共得到35 421個轉錄本，N50為1 744 bp，平均長度為1 208 bp，GC占比41.14%；獲得27 353 條Unigene，N50為1 731 bp，平均長度1 138 bp，GC占比41.33%。其中在CK、HT和LTC中均表達的Unigene有20 219 個。

表1 黃皮轉錄組組裝信息Table 1 Statistics of transcriptome assembly information of wampee

2.5 Unigene功能注釋及分析

將得到的Unigene與Nr、Swiss-prot protein database、KEGG、COG/KOG等數據庫中已知序列進行比較，獲取Unigene注釋信息。將四大數據庫注釋的Unigene通過Venn圖分析不同Unigene與數據庫之間的關系。分析得出，不同數據庫都注釋到的Unigene數為6 533 條，占注釋Unigene總數的23.9%（圖4A）。21 696 條Unigene被至少一個數據庫成功注釋，占全部Unigene的79.32%。Nr數據庫比對注釋獲得的Unigene數最多，有21 658 條，占了Unigene總數的34%。其中有15 841 條Unigene比對到Swissport數據庫。用于KEGG途徑和KOG分析的分別有8 044 條和13 097 條Unigene（圖4B）。轉錄本注釋比例均高于Unigene，說明大部分基因得以注釋（圖4C）。37.95%的Unigene（10 381）與臍橙（Citrus sinensis）基因序列相似，其次是可可（6.59%，Theobroma cacao，1 802）和土瓶草（5.15%，Cephalotus follicularis，1 408）（圖4D）。可注釋基因絕大部分來自于同屬蕓香科的臍橙和同為熱帶植物的可可，注釋結果可靠性較高。

圖4 轉錄組數據功能注釋與分析Fig. 4 Functional annotation of RNA-Seq data for each database

2.6 DEGs篩選結果

為篩選出DEGs，將CK-0 d vs CK-6 d、CK-6 d vs HT-6 d、CK-6 d vs LTC-6 d轉錄組數據分別進行比較。由圖5可知，CK-0 d vs CK-6 d，共篩選出9 342個DEGs，其中CK-6 d組相對于CK-0 d組下調表達基因3 800 個，占總差異表達40.7%，上調表達基因5 542個，占總差異表達59.3%。CK-6 d vs HT-6 d，共篩選出1 631個DEGs，其中HT-6 d下調表達基因754個，占總差異表達46.2%，上調表達基因877個，占總差異表達53.8%。CK-6 d vs LTC-6 d，共篩選出5 404個DEGs，其中LTC-6 d下調表達基因3 097個，占總差異表達57.3%，上調表達基因2 307個，占總差異表達42.7%。

圖5 CK-0 d vs CK-6 d（A）、CK-6 d vs HT-6 d（B）、CK-6 d vs LTC-6 d（C）對比DEGs火山圖和DEGs數量（D）Fig. 5 Volcano plots of DEGs in control group on day 0 versus day 6 (A),control group on day 6 versus HT group on day 6 (B), control group on day 6 versus LTC group on day 6 (C), and barplot of DEGs number (D)

2.7 DEGs GO富集分析

對不同處理的黃皮果實產生的DEGs進行GO富集分析。由圖6可知，對CK-0 d vs CK-6 d、CK-6 d vs HT-6 d、CK-6 d vs LTC-6 d進行顯著富集，發現3 組比較中DEGs在分子功能、生物過程和細胞組成三大功能類別均有分布。3 組比較產生的DEGs在GO富集分析中呈現一定共性，在生物過程類別中，DEGs主要富集在代謝過程、細胞過程、單細胞體過程；在細胞組分中，DEGs主要富集在細胞、細胞膜、細胞器；在分子功能中，DEGs主要富集在催化活性、結合。DEGs在代謝過程、細胞器、催化活性等的功能分類，說明HT、LTC處理改變了黃皮果實內部的代謝和酶的催化功能。

2.8 DEGs通路顯著性富集分析

對3 組比較產生的DEGs繼續進行通路顯著性富集分析，CK-0 d vs CK-6 d共有1 392個基因被注釋到126 條KEGG代謝通路中；CK-6 d vs HT-6 d組有208個基因被注釋到86 條KEGG代謝通路中；CK-6 d vs LTC-6 d組有747個基因被注釋到122 條KEGG代謝通路中。如表2所示，3 組比較中都顯著富集的代謝通路有信號轉導、糖代謝和次生代謝產物生物合成等，這些途徑大多與黃皮果實采后生理代謝相關。并且，苯丙素生物合成、黃酮類化合物的生物合成和植物激素信號轉導等途徑與黃皮果實抗氧化物質代謝相關，可能參與了黃皮果實采后氧化褐變調控。

表2 黃皮褐變相關通路（P＜0.05）Table 2 Pathways related to the browning process of wampee fruit (P ＜ 0.05)

圖6 CK-0 d vs CK-6 d（A）、CK-6 d vs HT-6 d（B）和CK-6 d vs LTC-6 d（C）中DEGs的GO富集結果Fig. 6 GO enrichment of DEGs in control group on day 0 versus day 6 (A), control group on day 6 versus HT group on day 6 (B), and control group on day 6 versus LTC group on day 6 (C)

2.9 抗氧化相關基因篩選與差異表達

PAL、SOD、CAT、POD、APX、GR、GPX和GST等為常見的抗氧化酶編碼基因，在抑制果實褐變、品質劣變等方面起著重要的作用[32-35]。為了進一步分析在不同處理條件下誘導差異表達的抗氧化酶編碼基因，在轉錄組數據中篩選出了76個抗氧化相關DEGs（圖7），其中，CK-0 d vs CK-6 d比較有62個抗氧化相關基因，CK-6 d相對于CK-0 d下調基因17個，上調基因45個；CK-6 d vs HT-6 d比較有7個抗氧化相關基因，HT-6 d下調基因4個，上調基因3個；CK-6 d vs LTC-6 d比較有31個抗氧化相關基因，LTC-6 d下調基因24個，上調基因7個；HT-6 d vs LTC-6 d比較有34個抗氧化相關基因，LTC-6 d下調基因26個，上調基因8個。在4 組對比中可以發現，抗氧化基因在0 d和6 d中、不同處理中均存在差異表達。不同的抗氧化基因可能受不同處理誘導而參與黃皮果實品質劣變過程。

圖7 4 組對比抗氧化性相關DEGs數目Fig. 7 Number of up-regulated and down-regulated genes associated with antioxidant activity

利用基因表達量熱圖，進一步分析這76個抗氧化相關基因的差異表達模式（圖8A）。結果顯示，第I、II類基因均在黃皮貯藏過程中下調表達，說明這兩類基因可能與黃皮果實采后正常衰老過程有關。與CK相比，HT和LTC處理均顯著抑制了第IV類基因（1個PAL基因、4個POD基因、1個GPX基因、7個GST基因）表達的上升，并與黃皮果實貯藏前期抗氧化酶活性的變化趨勢一致；相關性分析表明，第IV類基因與抗氧化活性（DPPH自由基清除率）呈負相關或相關性較小，而與褐變指數正相關（圖8B），說明第IV類基因可能通過降低貯藏前期抗氧化活性強度，從而維持貯藏中后期較高的總抗氧化活性，達到延緩褐變的效果。HT處理顯著誘導第V類基因（1個CAT基因、1個POD基因、3個GST基因、1個APX基因）的上調表達，LTC處理顯著誘導第VII（3個POD基因、2個SOD基因、1個GST基因）和X類基因（2個POD基因、2個APX基因、1個GST基因、1個GPX基因）的上調表達，相關性分析表明，第VII類基因與DPPH自由基清除率正相關或相關性不顯著，而與褐變指數負相關或相關性不顯著（圖8B），說明這一類基因可能不是控制褐變的關鍵基因；第V、X類基因均與DPPH自由基清除率和褐變指數正相關（圖8B），說明這兩類基因可能在黃皮果實中后期發揮作用，參與褐變的抑制。

圖8 黃皮果實抗氧化相關DEGs表達量熱圖（A）及其與抗氧化和褐變相關性分析（B）Fig. 8 Heatmap analysis of antioxidation-related DEGs (A) and their correlation with antioxidant activity and browning (B) in wampee fruit

HT和LTC處理對果實抗氧化酶活性及相關基因誘導的效果與其他果實報道類似，Huan Chen等[36]研究表明，HT處理可上調SOD、CAT、APX等抗氧化相關基因表達，延緩桃果實采后低溫貯藏過程中的褐變。Li Xia等[37]研究表明，LTC處理可通過持續誘導抗氧化系統相關酶活性，從而延緩紅薯褐變的發生。說明提高抗氧化活性是延緩果實褐變發生的重要途徑，相關研究報道，冷馴化[30]、乙醇[38]、UV-C[39]、蘋果多酚[31]和褪黑素[40]等處理均可通過增強SOD、POD、CAT等酶和抗氧化活性，誘導相關基因的表達，從而延緩果實褐變的發生。

3 結 論

本實驗采用HT（50 ℃/30 s）、LTC（8 ℃/4 d）和CK（3 ℃）處理黃皮果實并3 ℃貯藏，發現LTC處理能有效抑制黃皮果實失水和褐變，HT和LTC處理可以顯著推遲黃皮果實抗氧化酶和抗氧化活性高峰的出現，增強自由基清除能力，從而延長貯藏或貨架壽命。對第0天和第6天的黃皮果實RNA進行測序分析，共得到35 421個轉錄本；并在CK-6 d vs HT-6 d和CK-6 d vs LTC-6 d中分別發現1 631個和5 404個DEGs。GO富集分析結果顯示，這些DEG主要集中在生物過程中的代謝過程、分子過程。KEGG通路富集分析這些DEGs主要集中于苯丙素生物合成、黃酮類化合物的生物合成和植物激素信號轉導途徑等。從黃皮轉錄組數據中篩選得到76個抗氧化酶相關編碼基因，基因表達量熱圖和相關性分析結果表明，這76個基因的表達模式可以聚為10 類。HT和LTC處理通過抑制第IV類基因表達的上升，降低黃皮果實貯藏前期抗氧化活性強度，從而維持貯藏后期較高的總抗氧化活性延緩褐變的發生。HT和LTC處理分別通過誘導第V類和第X類基因的表達，增強貯藏后期抗氧化活性，從而達到延緩褐變發生。因此，HT和LTC分別通過不同的途徑提高黃皮果實貯藏過程中的抗氧化能力，其中第IV、V、X類基因可能為抑制黃皮褐變的關鍵基因。本研究為黃皮的品種選育和品種改良等提供理論基礎。