β-arrestin-2靶向NF-κB通路抑制類風濕性關節炎中FLSs的炎性反應

曹 峰 黃 承 程繼偉 余 霄

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)能夠導致軟骨和骨骼的進行性破壞，其主要特征是滑膜發炎[1]。成纖維樣滑膜細胞 (fbroblast-like synoviocyte, FLS) 作為滑膜的主要組成部分，其產生的促炎性細胞因子和基質金屬蛋白酶能夠致使軟骨破壞[2]。因此，抑制FLS炎性反應是RA的有效治療手段。有研究顯示，阻斷RA的關鍵轉錄途徑之一的NF-κB信號通路的信號傳遞可以調控RA引起的炎性反應[3]。β-arrestin-2蛋白是G蛋白偶聯受體-β腎上腺素受體重要調節蛋白2[4]。已有研究顯示，β-arrestin-2在RA等多種炎癥相關疾病中發揮抗炎作用[5，6]。β-arrestin-2能夠作為支架蛋白參與調控NF-κB通路，然而，目前在RA中關于β-arrestin-2調控NF-κB通路的研究較少[5]。本研究使用膠原誘導的關節炎(CIA)小鼠作為模型，分離獲取RA-FLSs細胞，并在該細胞中探討β-arrestin-2對RA-FLS炎性反應的影響，結果證實β-arrestin-2通過NF-κB通路抑制炎性因子的產生。本研究闡明β-arrestin-2通過NF-κB通路影響FLS炎性反應，為開發RA新的治療靶點提供了新的理論依據。

材料與方法

1.試劑:牛Ⅱ型膠原(20021)購自美國Chondrex公司，弗氏完全佐劑(P2036-50ml)、弗氏不完全佐劑(P2031-50ml)購自上海碧云天生物技術， DMEM培養基(SH30022.01)、胎牛血清(SH30070.03)、PBS(SH30256.01B)購自美國Hyclone公司，總RNA提取試劑盒(R1200-50)購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白提取試劑盒(BC3710)，BCA蛋白質定量檢測試劑盒(C503021-0500)，兔抗GAPDH多克隆抗體(D110016-0100)購自生工生物工程股份有限公司，兔抗Phospho-IκBα單克隆抗體(2859S)、兔抗IκBα單克隆抗體(4812S)、兔抗Phospho-P65單克隆抗體(3033S)、兔抗P65單克隆抗體(8242S)購自美國Cell Signaling Technology公司，MMP3單克隆抗體(MA5-17123)、兔抗MMP13單克隆抗體(MA5-14238)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

2.實驗動物：實驗所用SPF級，6～8周齡，DBA/1雄性小鼠購自浙江省實驗動物中心，25 ℃下飼養，保持飼養環境潔凈。按照標準提供SPF級水與食物，保證小鼠的平均體質量為18±2g，適應飼養1周后，將小鼠分為正常組(8只)、CIA模型組(16只)。該實驗方案已通過浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理學委員會批準，倫理編號(ZJCLA-IACUC-20010018)。

3.構建小鼠CIA模型：將小鼠隨機分為空白組和CIA模型組?？瞻捉M：不接受牛Ⅱ型膠原免疫的正常小鼠；CIA模型組為接受牛Ⅱ型膠原免疫的小鼠。使用濃度為2mg/ml的牛Ⅱ型膠原蛋白，與完全弗氏佐劑等體積1∶1混合，同時冰浴，超聲乳化混勻，于小鼠尾巴根部皮下注射100μl進行首次免疫，21天后，進行加強免疫, 使用濃度為2mg/ml的牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑按照等體積1∶1混合，冰浴上超聲乳化混勻,于小鼠尾巴根部皮下注射100μl。

4.獲取RA-FLSs細胞:實驗前麻醉小鼠，分離裸關節滑膜組織，預冷含雙抗的PBS，冰上沖洗滑膜組織5次，然后將組織剪碎為1mm3碎片，膠原酶消化獲取RA-FLSs,以2×106的密度接種于25cm2細胞培養瓶，于含5%CO2的37 ℃培養箱中培養。密度達80%時，將構建的β-arrestin-2過表達質粒，轉染至細胞中，培養用于后續實驗。

5.實驗分組及細胞處理:將RA-FLSs細胞分為對照組(Control)、β-arrestin-2過表達組(β-arrestin-2 over)，qRT-PCR、Western blot法分別檢測IL-1β、IL-6、MMP3、MMP13及NF-κB通路中P65、p-P65、IκBα、p-IκBα蛋白的表達水平。

為進一步研究β-arrestin-2是否靶向NF-κB調節RA-FLSs中炎性細胞因子和軟骨基因的分泌與表達，將細胞分為對照組(Control)、β-arrestin-2過表達組(β-arrestin-2 over)、NF-κB通路抑制劑對照組(BAY 11-7082)、NF-κB通路抑制劑+β-arrestin-2過表達組(BAY 11-7082+β-arrestin-2 over)，在細胞處理48h后，qRT-PCR檢測細胞炎性因子和相關調控基因的表達。

6.qRT-PCR：棄掉細胞培養上清，使用RNA提取試劑盒處理細胞獲得RNA，反轉錄獲得cDNA，適當稀釋后，在ABI 7500 qPCR儀中檢測IL-1β、IL-6的轉錄水平，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法分析各mRNA相對表達量。引物序列詳見表1。

表1 上下游引物序列

7.Western blot法檢測:收集樣品提取總蛋白，滴定濃度，制備蛋白樣品，電泳(80V,120min)、轉膜(100V,120min)、脫脂奶粉封閉(5%，1h)，洗膜(3次，10分鐘/次)，加入稀釋后的一抗(MMP3、MMP13、Phospho-IκBα、IκBα、Phospho-P65、P65)，孵育過夜，加入稀釋好的二抗，ECL顯色液混合均勻，滴加在PVDF膜上，曝光顯影。

8.統計學方法：使用GraphPad Prism 8.0.1進行數據統計分析，Unpairedt檢驗統計學差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.成功制備CIA模型:第2次免疫后觀察小鼠的兩后足踝關節，包括足趾與足掌出現嚴重紅腫現象，并通過游標卡尺測量以比較不同時期足趾腫脹程度(表2)。通過比較發現，模型組大鼠的各個關節明顯膨大變形(圖1)。與RA患者有相似的病理學特征，說明小鼠模型制備成功。

表2 正常組和CIA模型組不同時期左足腫脹程度比較

圖1 CIA模型制備成功A.正常組；B.CIA模型組

2.β-arrestin-2抑制RA-FLSs中促炎性細胞因子分泌：在初次免疫后第45天對CIA模型組小鼠進行麻醉，并切除踝關節滑膜組織，處理后獲得RA-FLSs。有研究報道顯示，β-arrestin-2在FLS中的異常表達，并且在RA等多種炎癥相關疾病中發揮抗炎作用[5]。因此，為了研究β-arrestin-2對RA-FLSs的作用，在RA-FLS細胞中過表達β-arrestin-2(圖2 A)，通過TNF-α(TNF-α是RA發病機制中最常見的促炎性刺激物)刺激細胞24h，通過qRT-PCR檢測炎性因子IL-1β、IL-6 mRNA的水平，結果顯示，與對照組比較，β-arrestin-2過表達處理會降低RA-FLSs細胞中炎性因子的水平(圖2B、C)[7]。

圖2 RA-FLSs中β-arrestin-2、炎性因子水平檢測A.β-arrestin-2表達情況；B.IL-1β mRNA表達水平；C.IL-6 mRNA表達水平；與對照組比較，*P<0.05

3.β-arrestin-2抑制RA-FLSs中軟骨基因表達：有研究顯示MMP3能夠破壞關節組織，而MMP13在基質破壞中具有重要作用，因此同時對RA-FLSs中MMP3、MMP13的表達水平進行檢測，與對照組比較，β-arrestin-2過表達處理會降低RA-FLSs中MMP3和MMP13的表達水平(圖3)。

圖3 RA-FLSs中MMP3和MMP13表達水平

4.β-arrestin-2抑制RA-FLSs中NF-κB通路：為了研究RA-FLSs中的NF-κB通路，筆者檢測了細胞中NF-κB通路相關蛋白的表達情況。與對照組比較，過表達β-arrestin-2會顯著降低p-P65和p-IκBα表達水平(圖4)。

圖4 RA-FLSs中NF-κB通路相關蛋白表達水平

5.β-arrestin-2通過NF-κB通路抑制RA-FLSs細胞炎性因子分泌和軟骨基因表達：為了驗證β-arrestin-2通過調控NF-κB通路影響RA-FLSs細胞炎性因子分泌和軟骨基因表達，通過β-arrestin-2或NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082處理RA-FLS細胞。發現在β-arrestin-2或BAY 11-7082均能夠抑制炎性因子和軟骨基因的水平，而上述水平在β-arrestin-2 over+BAY 11-7082組中進一步降低(圖5)。

圖5 RA-FLSs中軟骨基因、炎性因子水平A.MMP3和MMP13表達水平；B.IL-6；C.IL-1β；與對照組比較，*P<0.05；與β-arrestin-2過表達組或BAY 11-7082組比較，#P<0.05

討 論

RA常表現為滑液中炎性細胞增多，是一種自身免疫性疾病。在疾病的發展過程中，關節軟骨持續性受損，也可引起機體其他部位的損傷，在RA的病程中，常導致滑膜、關節、軟骨等組織的不可逆損傷[8,9]。但目前關于RA機制的研究尚不十分明確，缺乏有效的治療措施，目前主要使用的藥物有：非留體抗炎藥(non-retained anti-inflammatory drugs, NSAIDs)、傳統慢性抗風濕藥、糖皮質激素類等藥物，也包括生物制劑和基因治療等，但現有臨床藥物無法根治RA，且常伴隨一些不良反應，因此亟待探索新的治療策略[10]。

FLS是滑膜組成中的重要成分，在RA的起始、持續中的作用十分關鍵，其能夠產生炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β等)，并且可以與浸潤的炎性細胞互作，引起滑膜病變、關節破壞，致使關節軟骨退化，近關節骨組織受損[11, 12]。軟骨細胞受到來自FLS分泌的促炎性細胞因子、趨化因子的刺激，表達的金屬蛋白酶能夠降解包含軟骨、軟骨下骨在內的結締組織，使關節受損更加嚴重[9]。作為影響RA的重要因素之一，FLS的增多、移位都影響RA的炎性反應過程，或許能夠通過調節FLS的功能，達到治療RA的目的。因此，本研究自小鼠CIA模型中分離RA-FLSs細胞作為研究對象用于后續實驗。

β-arrestin-2作為G蛋白偶聯受體的調節蛋白，可以參與調控NF-κB通路，調節細胞因子的分泌[5]。其中IL-1β、IL-6、IL-17和腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎性細胞因子在RA的疾病進程中有著重要作用[13]。本研究在過表達RA-FLSs中β-arrestin-2后，對IL-1β、IL-6的表達水平進行了檢測，結果顯示，IL-1β、IL-6 mRNA的表達水平下調，說明過表達β-arrestin-2能夠抑制促炎性細胞因子的釋放。在RA疾病發展中產生的IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子能夠刺激基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的產生，這些蛋白酶常導致軟骨、肌腱等組織的不可逆損傷[14]。其中MMP3能夠導致多種類型膠原蛋白的降解，破壞關節組織；MMP13除了膠原蛋白，也降解蛋白多糖分子，在基質破壞中具有雙重的作用[15]。本研究通過Western blot法檢測了MMP3、MMP13的表達情況，結果顯示，β-arrestin-2抑制RA-FLSs中軟骨基因MMP3、MMP13的表達，其作用趨勢與細胞因子相一致。

NF-κB信號通路的活化影響IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子的分泌，為進一步明確β-arrestin-2是否通過NF-κB通路發揮抑制炎癥作用，首先通過Western blot法檢測p-P65、P65、p-IκBα、IκBα的蛋白表達水平，結果顯示這幾種蛋白的表達下調，表明β-arrestin-2可以抑制RA-FLSs中NF-κB通路的活化[16]。作為RA發病機制中重要通路之一，靶向NF-κB是治療RA的策略之一[17]。在RA患者、CIA模型中，NF-κB均有激活，已有研究證明通過抑制NF-κB信號通路的活化，能夠緩解膠原誘導的小鼠RA中炎癥與關節組織的破壞[18]。為明確β-arrestin-2是否靶向NF-κB通路影響RA-FLSs細胞炎性因子、軟骨基因的分泌和表達，本研究通過使用β-arrestin-2、BAY 11-7082處理RA-FLSs細胞，結果顯示β-arrestin-2、BAY 11-7082均能降低炎性因子和軟骨基因的水平，且二者共同處理后，上述水平進一步降低。

綜上所述，β-arrestin-2可以通過靶向抑制NF-κB信號通路的活化，下調IL-1β、IL-6等炎性細胞因子的分泌水平，抑制RA-FLSs的炎性反應，抑制軟骨基因MMP3、MMP13的表達。本研究為RA新的治療靶點的研究提供了新的思路，為進一步明確β-arrestin-2是否能夠緩解RA奠定了基礎。