泮托拉唑對急性肺損傷模型大鼠和人肺微血管內皮細胞損傷的作用及作用機制*

陳慶賢，劉立偉，吳茂森

（海南西部中心醫院藥劑科，海南 儋州 571799）

急性肺損傷（ALI）及急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是由各種非心源性原因引起的肺毛細血管內皮和肺泡上皮損傷，血管通透性增高的臨床綜合征［1］。ALI的臨床死亡率高達45%［2］，故進一步探索有效治療ALI的藥物具有重要意義。泮托拉唑是一種質子泵抑制劑，是治療消化不良、胃食管反流病、消化性潰瘍等多種胃食管疾病的有效胃酸分泌拮抗劑［3］，通過抑制內皮細胞和胃壁細胞核因子?κB（NF?κB）的激活，調節多形核中性粒細胞中的鈣離子濃度，抑制中性粒細胞的遷移等不同作用機制，以減輕炎性損傷［4］。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路在代謝、增殖和自噬誘導過程中起著關鍵作用，自噬是細胞維持穩態的一種重要機制，脂多糖可誘導小鼠肺上皮和人支氣管上皮細胞mTOR磷酸化，并抑制自噬［5］。本研究中探討了泮托拉唑通過mTOR信號通路調控自噬對大鼠ALI和內皮細胞損傷的影響，為開發新的ALI治療藥物提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、動物與細胞

儀器：Multiskan FC型酶標儀（賽默飛世爾科技<中國>有限公司）；CytoFLEX V2?B4?R2型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；E200型光學顯微鏡（日本尼康公司）；BIO?RADXR型凝膠成像分析系統（美國伯樂公司）。

試藥：泮托拉唑（批號為CC2261），地塞米松（批號為D4902），氯喹（批號為C6628），脂多糖（批號為916374），均購自美國Sigma Aldrich公司；大鼠腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、白細胞介素6（IL?6）、白細胞介素1β（IL?1β）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒，均購自上海江萊生物科技有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒（德國Roche公司）；Annexin V FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；LC3，Beclin1，mTOR，p?mTOR，甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，均購自英國Abcam公司；BeyoECLStar特超敏電化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

動物與細胞：SPF級成年雄性SD大鼠48只，體質量220～250 g，購自海南省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（瓊）2020?0007，飼養于（20±2）℃條件下，提供充足飲水及飼料，適應性飼養1周。

細胞：人肺微血管內皮細胞（HPMECs，上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號為3000）。

1.2 方法

脂多糖誘導ALI大鼠模型分組及給藥：將48只SD大鼠隨機分為正常對照組，脂多糖組，陽性對照組，泮托拉唑低、高劑量組，泮托拉唑高劑量+氯喹組（氯喹為自噬抑制劑），各8只。除正常對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射5 mg/kg脂多糖，以建立ALI大鼠模型。蘇木精?伊紅（HE）染色見肺微血管內充血及出血，肺泡腔及肺泡隔內有大量中性粒細胞聚集；肺組織濕/干重比值明顯升高，血清炎性因子水平明顯上升，代表成功構建ALI模型［6］。注射30 min后，陽性對照組大鼠腹腔注射地塞米松2 mg/kg［7］，泮托拉唑低、高劑量組大鼠分別腹腔注射26，104 mg/kg泮托拉唑［8］，泮托拉唑高劑量+氯喹組大鼠腹腔注射104 mg/kg泮托拉唑和10 mg/kg氯喹［9］，正常對照組和脂多糖組注射等體積生理鹽水。24 h后進行后續實驗。

細胞培養與泮托拉唑給藥濃度確定：取HPMECs細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞密度為80%～90%時，0.25%胰酶液消化細胞，取100 μL HPMECs細胞（5×103個/孔）加入96孔板，12 h后分別向細胞中加入不同質量濃度泮托拉唑，即10 μg/mL組、20 μg/mL組、40 μg/mL組、80 μg/mL組、160 μg/mL組，空白組加入等體積生理鹽水。37℃、5%CO2條件下培養24 h后，向細胞中加入CCK?8（10μL/孔），37℃條件下孵育3 h。利用Multiskan FC型酶標儀于450 nm波長處測定各孔吸光度值。

HPMECs細胞分組、細胞損傷模型構建與給藥：將對數生長期的HPMECs細胞接種于6孔板（5×104個/孔），繼續培養24 h，將細胞隨機分為正常對照組，脂多糖組，陽性對照組，泮托拉唑低、高劑量組，泮托拉唑高劑量+氯喹組，各3孔。正常對照組和脂多糖組細胞給予等體積生理鹽水，其余各組細胞添加100μg/mL脂多糖［10］，刺激1 h，收集細胞。檢測到炎性因子水平較對照組明顯升高，表示成功構建HPMECs細胞損傷模型。脂多糖處理1 h后，陽性對照組添加100 nmol/L地塞米松［7］，泮托拉唑低、高劑量組分別添加泮托拉唑40，80 μg/mL，泮托拉唑高劑量+氯喹組添加泮托拉唑80μg/mL和氯喹5μmol/L［11］。繼續培養24 h后進行后續實驗。

HE染色：給藥24 h后，取大鼠肺組織，4%多聚甲醛固定72 h，用乙醇梯度脫水，用二甲苯使之透明。石蠟包埋，切片，脫蠟至水，蘇木精染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化數秒，流水洗滌，伊紅液浸染3 min。用乙醇梯度脫水，用二甲苯使之透明，中性樹膠封片。參考文獻［12］，對肺組織病理學變化進行評分。

肺組織濕/干重比值測定：給藥24 h后，麻醉大鼠，取右上肺，去除肺表面水分和血跡，稱定質量，即為濕重（W）。65℃恒溫箱干燥肺組織，48 h后稱定質量，即為干重（D）。計算各組大鼠W/D值。

TUNEL染色檢測肺組織凋亡：按HE染色項下方法進行肺組織石蠟切片，常規脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，3%H2O2浸洗10 min，加入蛋白酶K工作液，37℃反應20 min，PBS漂洗，滴加TUNEL反應混合液，濕盒中37℃孵育1 h；PBS漂洗，加入轉化劑，濕盒中37℃孵育20 min；PBS漂洗，DAB顯色；中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察。

肺組織和HPMECs細胞中TNF?α，IL?6，IL?1β水平測定：采集大鼠頸動脈血液標本，4℃條件下以1 000 r/min的轉速離心10 min，取血清。收集HPMECs細胞培養上清液，以10 000 r/min的轉速離心10 min，去除死細胞及細胞碎片等，吸取上清液，置新的無菌離心管中，分裝后凍存，后續實驗用。根據ELISA試劑盒說明書檢測血清和上清液中TNF?α，IL?6，IL?1β的水平。

流式細胞儀測定HPMECs細胞凋亡率：收集給藥處理后的HPMECs細胞，PBS清洗后，Binding Buffer重懸細胞，隨后加入Annexin V?FITC室溫避光孵育15 min，加入PI室溫避光孵育5 min，1 h內利用流式細胞儀檢測。

蛋白免疫印跡（Western blot）法測定蛋白表達：將大鼠肺組織剪碎，收集給藥繼續培養24 h后的HPMECs細胞，RIPA裂解液裂解組織和細胞，以10 000 r/min的轉速離心10 min，取上清液，采用蛋白質定量（BCA）法測定蛋白濃度。取30μg蛋白經SDS?PAGE分離，并轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入LC3（1∶1000）、

Beclin1（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）、p?mTOR（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗體，4℃條件下過夜孵育。加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液至膜上，用化學發光成像儀檢測。

CCK?8檢測細胞活性：取對數生長期的HPMECs細胞，按HPMECs細胞損傷模型分組，加入脂多糖誘導并給藥處理，在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，每孔加入20μL CCK?8溶液，2 h后利用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度值。細胞活力（%）=［A（加藥）?A（空白）］/［A（0加藥）?A（空白）］×100%。其中，A（加藥），具有細胞、CCK?8溶液和藥物溶液孔的吸光度，A（0加藥）為具有細胞、CCK?8溶液而無藥物溶液孔的吸光度值，A（空白）為沒有細胞孔的吸光度值。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0統計學軟件分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理學變化、W/D值、炎性因子水平

結果見圖1和表1。與正常對照組比較，脂多糖組大鼠肺組織病理學評分、W/D值及TNF?α，IL?6，IL?1β水平均顯著升高（P<0.05）；與脂多糖組比較，陽性對照組，泮托拉唑低、高劑量組大鼠肺組織上述指標均顯著降低（P<0.05）；與泮托拉唑高劑量組比較，泮托拉唑高劑量+氯喹組大鼠肺組織上述指標均顯著升高（P<0.05）。

2.2 大鼠細胞凋亡情況

結果見圖2和表1。與正常對照組比較，脂多糖組大鼠TUNEL陽性細胞數顯著增多（P<0.05）；與脂多糖組比較，陽性對照組，泮托拉唑低、高劑量組大鼠TUNEL陽性細胞數均顯著減少（P<0.05）；與泮托拉唑高劑量組比較，泮托拉唑低高劑量+氯喹組大鼠TUNEL陽性細胞數顯著增多（P<0.05）。

表1 大鼠肺組織病理學評分、W/D值、血清炎性因子水平和細胞凋亡情況比較（±s，n=8）Tab.1 Comparison of lung histopathological score，W/D ratio，serum inflammatory factor levels and apoptosis of rats（±s，n=8）

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與脂多糖組比較，#P<0.05；與泮托拉唑高劑量組比較，&P<0.05。表3至表4同。Note：Compared with those in the normal control group，*P<0.05（for Tab.1 and Tab.3?4）；Compared with those in the LPS group，#P<0.05（for Tab.1 and Tab.3?4）；Compared with those in the pantoprazole high?dose group，&P<0.05（for Tab.1 and Tab.3?4）.

組別正常對照組脂多糖組陽性對照組泮托拉唑低劑量組泮托拉唑高劑量組泮托拉唑高劑量+氯喹組F值P值給藥劑量2 mg/kg 26 mg/kg 104 mg/kg 104 mg/kg+10 mg/kg肺組織病理學評分（分）0.25±0.02 8.13±0.84*2.84±0.51*#5.07±0.65*#3.52±0.44*#5.48±0.61&145.346<0.001 W/D值3.22±0.34 5.63±0.40*3.13±0.28*#4.34±0.31*#3.95±0.24*#5.13±0.30&64.284<0.001血清炎性因子TNF?α 32.16±5.04 312.93±24.41*105.38±12.35*#191.81±28.67*#127.84±15.06*#243.11±24.07&134.475<0.001 IL?6 43.44±4.91 227.18±19.20*98.87±10.18*#163.41±14.61*#114.45±11.01*#186.89±13.18&115.836<0.001 IL?1β 100.34±9.96 290.73±23.19*127.28±13.67*#198.81±20.26*#142.47±13.84*#241.51±19.07&97.743<0.001 TUNEL陽性細胞數（個/每個視野）52.33±5.51 613.67±56.52*238.63±28.18*#483.67±36.53*#274.33±25.54*#552.67±35.02&178.745<0.001

A.正常對照組B.脂多糖組C.陽性對照組D.泮托拉唑低劑量組E.泮托拉唑高劑量組F.泮托拉唑高劑量+氯喹組圖1大鼠肺組織病理學變化（×400）A.Normal control group B.LPS group C.Positive control group D.Pantoprazole low?dose group E.Pantoprazole high?dose group F.Pantoprazole high?dose+chloroquine groupFig.1 Pathological changes of lung tissue of rats（×400）

A.正常對照組B.脂多糖組C.陽性對照組D.泮托拉唑低劑量組E.泮托拉唑高劑量組F.泮托拉唑高劑量+氯喹組圖2大鼠肺組織細胞凋亡TUNEL染色檢測結果（×400）A.Normal control group B.LPS group C.Positive control group D.Pantoprazole low?dose group E.Pantoprazole high?dose group F.Pantoprazole high?dose+chloroquine groupFig.2 TUNEL staining results of apoptosis in lung tissue of rats（×400）

2.3 HPMECs細胞炎性因子水平和細胞凋亡情況

結果見表2、表3和圖3。與空白組比較，160μg/mL組細胞活力顯著降低（P<0.05），其余組無明顯變化。故選取40μg/mL和80μg/mL作為使用濃度。與正常對照組比較，脂多糖組細胞TNF?α，IL?6，IL?1β水平及細胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）；與脂多糖組比較，陽性對照組，泮托拉唑低、高劑量組細胞上述指標水平均顯著降低（P<0.05）；與泮托拉唑高劑量組比較，泮托拉唑高劑量+氯喹組細胞上述指標水平均顯著升高（P<0.05）。

圖3 流式細胞儀檢測HPMECs細胞凋亡情況Fig.3 Apoptosis of HPMECs detected by the flow cytometry

表2 不同劑量泮托拉唑對HPMECs細胞活力的影響（±s，%，n=3）Tab.2 Effects of different doses of pantoprazole on cell viability of HPMECs（±s，%，n=3）

表2 不同劑量泮托拉唑對HPMECs細胞活力的影響（±s，%，n=3）Tab.2 Effects of different doses of pantoprazole on cell viability of HPMECs（±s，%，n=3）

注：與空白組比較，*P<0.05。Note：Compared with those in the blank group，*P<0.05.

組別空白組10μg/mL組20μg/mL組40μg/mL組細胞活力100.00±5.32 98.37±6.21 97.82±6.98 95.14±5.88組別80μg/mL組160μg/mL組F值P值細胞活力91.29±5.27 80.86±5.92*37.297<0.001

表3 HPMECs細胞TNF-α，IL-6，IL-1β水平及細胞凋亡率比較（±s）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-1β levels and apoptosis of HPMECs（±s）

表3 HPMECs細胞TNF-α，IL-6，IL-1β水平及細胞凋亡率比較（±s）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-1β levels and apoptosis of HPMECs（±s）

組別正常對照組脂多糖組陽性對照組泮托拉唑低劑量組泮托拉唑高劑量組泮托拉唑高劑量+氯喹組F值P值給藥劑量10 nmol/L 40μg/mL 80μg/mL 80μg/mL+5μmol/L TNF?α（pg/mL）19.36±2.02 42.85±3.28*21.05±1.87*#33.26±2.19*#25.18±1.93*#38.19±2.57&76.452<0.001 IL?6（pg/mL）11.29±0.96 27.37±2.12*13.28±1.24*#21.84±1.95*#15.72±1.01*#24.83±2.31&87.357<0.001 IL?1β（pg/mL）32.13±2.47 74.75±6.82*35.45±3.23*#51.57±5.48*#38.23±3.11*#62.39±5.84&63.395<0.001細胞凋亡率（%）4.58±0.38 16.24±1.03*6.86±0.57*#11.12±1.07*#7.66±0.63*#13.13±0.83&137.182<0.001

2.4 泮托拉唑激活ALI模型大鼠細胞自噬

結果見圖4、圖5和表4。與正常對照組比較，脂多糖組大鼠肺組織和HPMECs細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1的表達水平均顯著降低（P<0.05）；與脂多糖組比較，陽性對照組，泮托拉唑低、高劑量組大鼠肺組織和HPMECs細胞中的表達水平均顯著升高（P<0.05）；與泮托拉唑高劑量組比較，泮托拉唑高劑量+氯喹組大鼠肺組織和HPMECs細胞中上述指標的表達水平均顯著降低（P<0.05）。

表4 大鼠肺組織和HPMECs細胞中LC3，Beclin1，p-mTOR/mTOR表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of LC3，Beclin1 and p-mTOR/mTOR expression levels in lung tissue of rats and HPMECs（±s）

組別正常對照組脂多糖組陽性對照組泮托拉唑低劑量組泮托拉唑高劑量組泮托拉唑高劑量+氯喹組F值P值LC3Ⅱ/LC3Ⅰ肺組織（n=8）0.64±0.05 0.12±0.01*1.38±0.13*#0.41±0.03*#1.36±0.14*#0.11±0.01&142.289<0.001 HPMECs細胞（n=3）0.94±0.09 0.21±0.02*0.96±0.11*#0.62±0.07*#0.87±0.09*#0.17±0.02&134.758<0.001 Beclin1肺組織（n=8）0.22±0.03 0.09±0.00*0.64±0.05*#0.26±0.03*#0.53±0.04*#0.35±0.04&115.046<0.001 HPMECs細胞（n=3）0.87±0.09 0.11±0.01*0.84±0.08*#0.20±0.02*#0.65±0.06*#0.13±0.01&117.043<0.001 p?mTOR/mTOR肺組織（n=8）0.11±0.01 0.98±0.11*0.20±0.02*#0.64±0.06*#0.45±0.03*#0.42±0.04&132.246<0.001 HPMECs細胞（n=3）0.13±0.01 1.15±0.12*0.25±0.03*#0.44±0.03*#0.32±0.03*#0.30±0.03&121.035<0.001

1.正常對照組2.脂多糖組3.陽性對照組4.泮托拉唑低劑量組5.泮托拉唑高劑量組6.泮托拉唑高劑量+氯喹組圖5 HPMECs細胞LC3和Beclin1表達1.Normal control group 2.LPS group 3.Positive control group 4.Pantoprazole low?dose group 5.Pantoprazole high?dose group 6.Pantoprazole high?dose+chloroquine groupFig.5 Expression of LC3 and Beclin1 in HPMECs

2.5 泮托拉唑抑制mTOR信號通路激活

結果見圖6、圖7和表4。與正常對照組比較，脂多糖組大鼠肺組織和HPMECs細胞中p?mTOR/mTOR的表達水平均顯著升高（P<0.05）；與脂多糖組比較，陽性對照組，泮托拉唑低、高劑量組大鼠肺組織和HPMECs細胞中p?mTOR/mTOR的表達水平均顯著降低（P<0.05）；與泮托拉唑高劑量組比較，泮托拉唑高劑量+氯喹組大鼠肺組織和HPMECs細胞中p?mTOR/mTOR的表達水平均顯著升高（P<0.05）。

1.正常對照組2.脂多糖組3.陽性對照組4.泮托拉唑低劑量組5.泮托拉唑高劑量組6.泮托拉唑高劑量+氯喹組圖6大鼠肺組織p-mTOR和mTOR表達1.Normal control group 2.LPS group 3.Positive control group 4.Pantoprazole low?dose group 5.Pantoprazole high?dose group 6.Pantoprazole high?dose+chloroquine groupFig.6 Expression of p-mTOR and mTOR in lung tissue of rats

1.正常對照組2.脂多糖組3.陽性對照組4.泮托拉唑低劑量組5.泮托拉唑高劑量組6.泮托拉唑高劑量+氯喹組圖7 HPMECs細胞p-mTOR和mTOR表達1.Normal control group 2.LPS group 3.Positive control group 4.Pantoprazole low?dose group 5.Pantoprazole high?dose group 6.Pantoprazole high?dose+chloroquine groupFig.7 Expression of p-mTOR and mTOR in HPMECs

3 討論

ALI發病機制復雜，目前的治療方法存在明顯局限［13］。泮托拉唑可提高癌細胞對長春新堿的敏感性，誘導癌細胞周期阻滯，抑制遷移和侵襲［14］；可有效減輕膿毒癥急性肺、腎損傷，抑制腎小管上皮細胞凋亡［8］。本研究結果顯示，泮托拉唑干預可減輕ALI模型大鼠和HPMECs模型大鼠肺組織損傷，抑制炎性因子產生及細胞凋亡，發揮保護作用。

細胞自噬是生物體廣泛存在的細胞內自主降解過程，自噬不足或過度自噬均可導致ALI，將自噬水平調節至正常范圍可減輕ALI［15］。可見，自噬對ALI的發展具有雙重作用。研究表明，脂多糖誘導的ALI模型可明顯活化mTOR通路，抑制細胞自噬［16］，上調自噬水平可改善ALI［17］。本研究結果顯示，脂多糖誘導的ALI和HPMECs可明顯抑制細胞自噬，泮托拉唑干預可上調自噬水平，自噬抑制劑氯喹可逆轉泮托拉唑對ALI和HPMECs的保護作用。

mTOR作為一種保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調節細胞生長、增殖、運動、存活、自噬等上游通路的匯合點，抑制mTOR活化可促進細胞自噬［18］。在PM2.5誘導的ALI模型大鼠［19］中，mTOR被激活，導致下游細胞自噬水平受到抑制，黃芪甲苷通過抑制mTOR活化促進自噬，保護PM2.5誘導的ALI。本研究結果顯示，脂多糖誘導的ALI和HPMECs均可導致mTOR活化，泮托拉唑干預可抑制其活化，且自噬抑制劑氯喹對其活化無明顯影響。

綜上所述，泮托拉唑通過mTOR通路調節自噬，在ALI模型大鼠和HPMECs損傷中發揮保護作用。