結合虛擬單像素成像解卷積的雙邊照明光片熒光顯微技術*

胡金虎 林丹櫻? 張煒 張晨爽 屈軍樂 于斌?

1) (深圳大學物理與光電工程學院,光電子器件與系統教育部/廣東省重點實驗室,深圳 518060)

2) (佛山職業技術學院機電工程學院,佛山 528137)

光片熒光顯微術(light-sheet fluorescence microscopy,LSFM)采用薄片光束從側面激發樣品,在垂直于光片方向上進行成像,具有成像速度快、光學層析能力強以及光漂白和光毒性低等優點,適用于對較大活體生物樣品進行高質量、長時間三維動態觀測.然而,傳統高斯光束LSFM存在分辨率低和成像視場小的問題.本文在雙邊照明LSFM的基礎上,結合虛擬單像素成像解卷積技術,提出了一種大視場高分辨雙邊照明LSFM,實現了視場和分辨率的同時提升.設計和搭建了雙邊照明LSFM,開展了熒光珠和轉基因斑馬魚樣品的三維光切片顯微成像實驗,實驗結果證明了系統的三維高分辨成像能力,對于大視場、高分辨LSFM的發展和應用具有重要意義.

1 引言

光片熒光顯微術(light-sheet fluorescence microscopy,LSFM),也稱選擇性平面照明顯微術(selective plane illumination microscopy,SPIM)[1],它采用激發光路與探測光路相互垂直的特殊設計,即利用薄片光束從側面激發樣品,并通過垂直光片方向的顯微物鏡和探測器獲取照明層面的熒光圖像,從而避免非成像平面的熒光信號干擾,實現厚樣品的三維層析成像.與同樣具有光學層析成像能力的共聚焦及雙光子熒光顯微成像技術相比,LSFM采用光片面照明寬場成像取代點掃描成像方式,成像速度快,樣品受光照時間大幅縮短,光漂白和光毒性低,適用于對較大活體生物樣品進行高質量、長時間三維動態觀測.目前,LSFM已被廣泛應用于細胞生物學、發育生物學和神經生物學等領域的研究[2].

早期LSFM或SPIM中的照明光片一般是由高斯光束通過狹縫和柱面鏡聚焦產生的[3,4],能量利用率低,且光片沿傳播方向的強度不均勻,容易受樣品吸收和散射影響,光片有效照明深度有限,成像視場較小.Swoger等[5]和Krzic等[6]提出了雙邊照明LSFM,利用兩個相反方向的高斯光片同時激發樣品,成功減少了散射的影響,提升了照明深度,擴大了成像視場.2008年,Keller等[7]提出利用高斯光束快速掃描形成虛擬光片以進一步改善高斯光片的光強均勻性,不僅光能利用率高(可達95%),還可以生成多種類型的光片.但由于掃描速度很快,需要比靜態高斯光片更高的峰值激發功率.隨后LSFM研究進入一個高速發展階段,各種新型的LSFM相繼出現,并被廣泛應用于斑馬魚、果蠅等模式生物的發育過程研究[8,9].

然而這些基于高斯光束的LSFM技術在應用于強散射的活體組織等厚樣品成像時,其視場和分辨能力仍十分有限.為此,貝塞爾光束、艾里光束等無衍射光束被相繼應用于產生數字掃描的照明光片并較好地解決了LSFM視場受限的問題[10?13].但無衍射光束光片存在旁瓣,會導致非焦平面的樣品激發,既降低了成像質量,又增大了對樣品的光毒性,因此需要設法消除其影響[14].此外,也有文獻[15]報道了利用平鋪拼接的方法實現了大視場成像.為了進一步提高LSFM的空間分辨率,研究人員還將LSFM與多種超分辨熒光顯微術結合[16?23],以期實現對活體生物厚樣品的超高時空分辨顯微成像.例如,2014年,Betzig研究組[24]發明了晶格光片顯微術(lattice light-sheet microscopy,LLSM),利用貝塞爾光學晶格大幅減小了光片厚度并抑制了旁瓣,提升了LSFM的層析能力和掃描速度,結合結構光照明超分辨技術,LLSM可成功以較高的時空分辨率研究活細胞內甚至活體組織內的動力學過程.然而,受生物樣品散射影響,其典型的成像深度也只有20 μm,限制了在活體厚樣品中的應用,且這種技術光學掃描系統復雜,不便推廣應用.

綜上,如何在保持LSFM成像速度快、光學層析能力強的優勢基礎上實現對厚樣品的大視場、高分辨三維成像,仍然是LSFM發展及其推廣應用面臨的關鍵問題.研究和開發新型LSFM系統和方法,進一步提升其性能,使其更適用于活體厚樣品的高分辨快速三維成像,對于生命科學和生物醫學等領域的研究具有重要的意義.

本課題組在前期研究工作中提出了一種新的寬場超分辨成像解卷積算法,即虛擬單像素成像(virtual single-pixel imaging,v-SPI)[25]技術,采用數字結構光模板調制寬場熒光圖像,并根據積分等量關系將虛擬調制圖像轉換為單像素成像數據,進而結合單像素圖像重構技術獲得寬場超分辨圖像.v-SPI可將寬場熒光顯微成像的橫向分辨率提高2倍,與傳統結構光照明顯微術可相比擬,但由于只需采集單幅寬場圖像,成像速度至少提高了9倍.在此基礎上,本文提出了基于v-SPI的大視場高分辨雙邊照明LSFM (dual-sided illumination LSFM,dLSFM)成像方法和系統,實現了傳統高斯光束LSFM視場和分辨率的同時提升.設計和搭建了dLSFM系統,開展了熒光珠和斑馬魚樣品的三維光切片顯微成像實驗,驗證了系統的分辨率和視場;編制了v-SPI圖像重構程序,實現了厚樣品的高分辨光切片層析成像和三維圖像重構;實驗結果證明,系統具有同時提升LSFM視場和分辨率的能力,為高分辨率LSFM進一步發展及其在活體厚樣品快速高分辨成像方面的應用提供理論和技術基礎.

2 系統與方法

2.1 dLSFM系統設計與搭建

所搭建的雙邊LSFM系統示意圖如圖1所示.首先,波長為488 nm的固體激光器(Sapphire 488-200 CW CDRH,Coherent,)發出的激光束經透鏡L1 (f1=25 mm)和L2 (f2=250 mm)擴束準直后經反射鏡M1、分束鏡BS分為兩束:一束沿原方向傳播,經狹縫MS1、柱透鏡CL1聚焦后再經過照明物鏡IO1(10×/NA0.3水鏡,尼康)形成光片;另一束經反射鏡M2,M3和M4后,經狹縫MS2和柱透鏡CL2進入照明物鏡IO2,形成另一側的光片.其中,兩路光中狹縫、柱透鏡和物鏡的參數和相對位置保持相同,且物鏡的前焦面均要與柱透鏡的后焦面重合,光片的厚度和寬度可通過改變狹縫的寬度來調節.這樣,兩束激發光以相反方向匯入樣品池,生成的兩束光片在同一焦面處對樣品進行激發.樣品產生的熒光信號通過探測物鏡DO(40×/NA0.8水鏡,尼康)、濾光片F和管鏡TL,在高靈敏度sCMOS相機(ORCA-Fusion BT,像素數2304 × 2304,像素尺寸6.5 μm × 6.5 μm,濱松)上成像.樣品固定在一個4D微米位移臺(USB 4D-Stage,Picard Industries,)上,可在電機系統控制下實現X,Y,Z和R方向上的移動,實現成像區域的選擇和軸向掃描三維成像.

圖1 dLSFM 系統光路示意圖Fig.1.Schematic diagram of the dLSFM system.

2.2 光片性能參數分析

光片的厚度和寬度決定了LSFM的軸向分辨率和視場,且二者相互制約,由照明物鏡的等效數值孔徑NAill決定.光片的厚度和寬度均隨著NAill值的增大而減小,即系統軸向分辨率提升的同時成像視場變小.理想的LSFM成像要求光片厚度盡可能薄且強度均勻,因此如何生成厚度薄而視場大的光片一直以來都是LSFM追求的重要目標.本文所搭建的雙邊照明LSFM系統,與傳統單邊照明的高斯光束LSFM系統相比,能在保持光片厚度不變的情況下擴大系統的視場,還能通過改變狹縫的大小生成多種不同厚度和視場的光片,來適應不同的樣品成像.在本文涉及的實驗中,狹縫的寬度設置為6 mm,則相應的照明物鏡NAill值為0.15.可利用均勻羅丹明溶液對光片的光學參數進行標定.此時需要將柱面鏡旋轉90°,使光片方向垂直于探測面,從側面采集光片圖像,結果如圖2所示.對其強度分布進行高斯擬合,得到高斯光片束腰處的強度輪廓的半高寬(full width at half maximum,FWHM)厚度為1.9 μm,單邊照明時視場為53.8 μm,雙邊同時照明時在光片厚度不變的情況下視場為106.3 μm,近似為單邊照明時的2倍.

圖2 用于厚度和寬度標定的光片側視圖 (a) 通道I單邊照明時的光片;(b) 雙邊照明時的光片;(c) 通道II單邊照明時的光片Fig.2.Side view images of light sheet for thickness and width calibration:(a) Single-sided illumination with the path I;(b) dualsided illumination;(c) single-sided illumination with path II.

2.3 超分辨圖像重構方法

在寬場熒光顯微成像中,常用解卷積技術來濾除非焦面背景熒光噪聲,進而提高焦面圖像的對比度.與傳統的解卷積方法相比,v-SPI方法除了提高圖像對比度,還可以顯著提高圖像的分辨率,實現單幀寬場圖像的超分辨重構[25].其基本原理基于如下積分等量關系:

其中S為理想像(對應樣品的真實分布),h為系統的點擴散函數,?表示卷積運算,因此S?h為寬場圖像;P為虛擬數字模板,?表示點積運算,(S?h)·P表示對寬場圖像進行虛擬調制.

v-SPI技術首先采用虛擬數字模板調制普通寬場熒光圖像,然后根據該積分等量關系將虛擬調制圖像轉換為單像素成像數據,再結合單像素圖像重構技術實現超分辨圖像的重構.根據采集的熒光圖像、數字模板和系統點擴散函數計算出積分值和卷積模板.因此,可以采用SPI方程求解方法重構出待求的樣品分布.在實際樣品重構過程中使用的是簡單數字模板,每個模板上僅有一個像素亮度輪流設置為1,其余像素亮度設置為0.在本文中,v-SPI技術被用于改善dLSFM系統的空間分辨率,從而達到同時提升LSFM視場和分辨率的目的.

3 成像結果與討論

3.1 系統分辨率標定

為了驗證dLSFM系統的成像能力,以直徑100 nm的熒光珠為樣品對該系統的分辨率進行標定.在實驗之前,首先,利用體積濃度為1%的瓊脂糖溶液將原始熒光珠溶液(TetraSpeckTM微球,0.1 μm,1.8 × 1011個/mL,ThermoFisher)稀釋200倍左右,搖勻以后將混合溶液吸入到氟化乙烯丙烯(FEP)細管(外徑為1.6 mm,內徑為0.8 mm)中,在室溫下放置5 min左右,混合溶液成凝膠狀態,然后將FEP浸入到充滿水的樣品池中,從FEP中推出熒光珠凝膠,對熒光珠進行成像,結果如圖3所示.選取視場范圍內的若干熒光珠圖像進行分析和統計,以每個熒光珠強度分布曲線的FWHM作為其尺寸并進行統計分析(N=25),以其平均值表征系統的橫向分辨率(這里以X方向的分辨率為例).熒光珠尺寸的統計直方圖如圖3(b)和圖3(d)所示,其中前者為未采用v-SPI技術處理的結果,熒光珠直徑的平均值為407 nm±14 nm,后者為利用v-SPI處理后的結果,熒光珠直徑的平均值減小為300 nm±15 nm.可見,雙邊照明LSFM系統獲取的光片熒光顯微圖像經v-SPI技術處理后,橫向分辨率提升了約26%.

圖3 用于系統成像分辨率標定的直徑100 nm熒光珠圖像及其尺寸統計直方圖 (a) 未經v-SPI處理的圖像;(b) 圖(a)中熒光珠沿X方向強度曲線FWHM的直方圖分布(N=25);(c) 經v-SPI處理的圖像;(d) 圖(c)中相同熒光珠沿X方向強度曲線FWHM的直方圖分布;為平均值Fig.3.Images of 100-nm-diameter fluorescent beads for system resolution calibration:(a) Image without v-SPI processing;(b) the corresponding histogram distribution of the intensity profile FWHM from 25 fluorescent beads in X direction;(c) image with v-SPI processing;(d) the corresponding FWHM histogram distribution from the same beads in X direction; is the average value.

3.2 成像視場驗證

為了驗證雙邊照明LSFM系統的成像視場,選用心血管特異標記的轉基因斑馬魚(CZ62,s843 Tg/+,Tg(kdrl:EGFP),國家斑馬魚資源中心)作為實驗樣品進行成像.圖4所示為斑馬魚心臟附近血管結構的成像結果,其中圖4(a)為通道I成像結果,圖4(b)為雙通道成像結果,圖4(c)為通道II成像結果.從圖4中可以可出,單通道成像,即采用單邊照明時,由于樣品的散射,照明光束的穿透深度有限,成像視場受限;而雙邊照明可以成倍地增加穿透深度,擴大了系統的成像視場.

圖4 斑馬魚血管結構的大視場成像 (a) 通道I單邊照明成像;(b) 雙邊照明成像;(c) 通道II單邊照明成像Fig.4.Large FOV imaging of vascular structures in a zebrafish:(a) Single-sided illumination imaging with path I;(b) dual-sided illumination imaging;(c) single-sided illumination imaging with path II.

進一步地,通過比較雙邊照明LSFM系統獲取的大視場生物樣品圖像在經過v-SPI技術處理前后的效果,驗證本文所提技術在同時提升視場和分辨率方面的能力,結果如圖5所示.實驗樣品為神經系統特異性標記的轉基因斑馬魚(CZ79,ml3Tg/+,Tg(mnx1:mGFP),國家斑馬魚資源中心).圖5(a)為dLSFM系統采集的未經特殊處理的原始圖像,圖5(b)為采用傳統Richardson-Lucy(RL)解卷積算法處理的圖像,圖5(c)為采用v-SPI算法處理的圖像,圖5(d)為對三個圖像中劃線的同一位置的歸一化強度曲線.對比圖像(圖5(c))和強度曲線(圖5(d))可以明顯看出,雙邊照明LSFM系統獲取的大視場生物樣品圖像經v-SPI技術處理后,圖像的對比度和分辨率均得到明顯提升,且效果比傳統RL算法更好.該結果同時也和前文100 nm熒光珠的分辨率標定結果相符合.可見,結合了v-SPI技術的雙邊照明LSFM,可以在實現大視場成像的前提下獲得較高的分辨率,即同時實現LSFM視場和分辨率的提升,適合用于較厚生物樣品的成像.

圖5 斑馬魚運動神經元成像(a)未經特殊處理的圖像;(b)RL解卷積處理的圖像;(c) v-SPI處理圖像;(d) 圖(a)?(c)中黃色色實線標記位置的歸一化強度曲線Fig.5.Images of motoneurons in a zebrafish:(a) Image without special processing;(b) image with RL deconvolution;(c) image with v-SPI processing;(d) normalized intensity profiles along the yellow solid lines in panels (a)?(c).

3.3 厚樣品三維成像

為了驗證系統對厚樣品的三維成像能力,利用上述神經系統特異標記的轉基因斑馬魚作為樣品進行成像,通過微米位移臺的軸向移動采集運動神經元的光切片數據并進行三維重構.采集間隔為1 μm,共采集20幅源圖像進行三維重構,結果如圖6所示,其中圖6(a)—(c)為不同采集深度的二維圖像,圖6(d)和圖6(e)為三維重建后不同視角的效果圖.所有圖像均已用v-SPI技術進行處理.

圖6 斑馬魚運動神經元的三維成像 (a)?(c) 不同軸向位置拍攝的圖像;(d),(e)三維重建效果圖Fig.6.Three-dimensional imaging of motoneurons in a zebrafish:(a)?(c) Images from different axial positions;(d),(e) three-dimensional reconstruction renderings.

4 結論

本文將雙邊照明光片熒光顯微技術與虛擬單像素成像技術相結合,發展了一種大視場高分辨光片熒光顯微成像技術,相比傳統高斯光束LSFM,可將視場擴大至原來的兩倍(達到約100 μm),同時可將系統橫向分辨率提升約26%,并實現了對斑馬魚等較大生物樣品的三維高分辨率層析成像,為進一步開展活體生物樣品快速高分辨成像以及生物樣品的超分辨成像奠定了基礎.