紫草素通過促進巨噬細胞Ⅰ型干擾素的產生抑制病毒感染

胡莉蔓 陳旭央 阮旦青 （樂清市人民醫(yī)院兒科，溫州 325600）

2019 年12 月發(fā)現的新型冠狀病毒（SARSCoV-2）是一種新型單鏈RNA（ssRNA）病毒，它能引起嚴重的呼吸系統(tǒng)疾?。–OVID-19），且導致了全球大流行，對全人類的健康構成了嚴重威脅［1］。在病毒感染發(fā)生時，天然免疫是抵抗病毒感染的第一道防線。天然免疫細胞，如巨噬細胞和樹突狀細胞，通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體相關的分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），如病毒核酸RNA和DNA，來響應病毒感染，快速啟動免疫應答反應［2］。病毒RNA 主要由TLRs 成員（TLR3、7、8）和RLRs 成員（RIG-1、MDA5）等受體識別［3］；病毒DNA 主要由STING等受體識別。病毒核酸成分被模式識別受體識別后，募集下游接頭蛋白包括TRIF、MAVS 和STING，隨后激活下游激酶TBK1，從而激活NF-κB和轉錄因子IRF-3/7 并誘導Ⅰ型干擾素和促炎細胞因子的產生。Ⅰ型干擾素能夠誘導大量干擾素誘導基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的表達。干擾素誘導基因不僅可以抑制病毒從入侵到釋放的多個階段，還可以反饋調節(jié)干擾素的表達，從而最終控制病毒感染［4-5］。但是，諸如H1N1、HSV 等病毒同樣可以通過抑制Ⅰ型干擾素的產生來逃脫宿主的殺傷［6］。因此，促進天然免疫應答是抵抗包括冠狀病毒SARS-CoV-2在內的病毒感染的有效策略。

紫草素是從傳統(tǒng)中藥紫草中提取的萘醌類化合物［7］。研究發(fā)現紫草素能夠抑制炎癥反應、抗細胞凋亡、抗氧化和促進血管生成，從而能夠改善糖尿病患者早期視網膜病變等癥狀［8-9］。此外，紫草素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，通過阻滯細胞周期、促進腫瘤細胞凋亡、抑制癌細胞轉移和侵襲、誘導自噬和壞死等方式，紫草素可以有效抑制乳腺癌、宮頸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展［10-14］。但是，紫草素在病毒感染中的作用尚不清楚。本課題以小鼠和巨噬細胞為研究對象，旨在探討紫草素對小鼠和巨噬細胞抵抗水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）感染的影響及其機制，并為抵抗SARS-CoV-2提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠 C57BL/6 J小鼠（6～8周齡）購自SIPPRBK 實驗動物有限公司。將所有小鼠飼養(yǎng)在浙江大學實驗室動物中心（沒有特定病原體的環(huán)境），所有動物實驗均按照動物倫理委員會批準的規(guī)程進行（批號：ZJU-BEFS-2019015），并符合機構指導原則。

1.1.2 原代巨噬細胞 骨髓來源的巨噬細胞（bone marrow derived macrophages，BMDM）由小鼠骨髓誘導產生。從小鼠的股骨和脛骨收集骨髓細胞，將 20 ng/ml 重組小鼠 M-CSF（R&D 公司，416-ML）添加到含有10%FCS 的RPMI1640 培養(yǎng)基中，誘導BMDM。

1.1.3 試劑 紫草素（MCE公司，HY-N0822）；IFN-β ELISA 試劑盒（Invivogen 公司，luex-mifnbv2）；IL-6 ELISA 試劑盒（Invitrogen 公司，88-7064-88）；RNAiso plus（TaKaRa 公司，9109）；逆轉錄試劑盒（Toyobo 公司，FSQ-201）；SYBR Green master Rox（Roche 公司，04707516001）；細胞裂解緩沖液（Cell Signling Technology 公司，9803）和蛋白酶抑制劑（Sigma 公司，P8340）；BCA 試劑盒（Pierce 公司，23235）；Pierce 化學發(fā)光 ECL 試劑盒（Thermo 公司，32209）；RNAiso plus 試劑（TaKaRa 公司）；逆轉錄酶（Toyobo 公司）；SYBR Green master Rox（Roche公司）；聚偏二氟乙烯膜（Bio-Rad 公司）；TBK1 抗體（3504）、p-TBK1 抗體（5483）、IRF3抗體（4962）、p-IRF3抗體（4947）、p-JNK抗體（9251）、JNK 抗體（9252）、p-p65 抗體（3033）、p65 抗體（8242）、p-p38 抗體（9215）和 p38 抗體（9212）均購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染 用 VSV（MOI=0.1 或 1）或者VSV-GFP（MOI=1）感染骨髓來源的巨噬細胞進行細胞實驗。通過腹腔內注射VSV（劑量1×108PFU/g）感染小鼠進行體內研究。

1.2.2 VSV TCID50 測定 分別獲取感染VSV 小鼠的脾臟、肝臟和肺臟組織上清以及感染VSV 的巨噬細胞上清液，利用倍比稀釋方法稀釋上清液，加入到Vero 細胞上進行感染。然后用含有0.6%低熔點瓊脂糖的生長培養(yǎng)基覆蓋細胞。16 h 后，利用0.5%結晶紫進行染色，并計數形成的噬菌斑。

1.2.3 細胞分析 原代巨噬細胞在GFP-VSV 感染16 h 后，用胰蛋白酶消化細胞并用PBS 洗滌。重懸于100 μl PBS中，通過流式細胞儀（FACS）分析細胞。

1.2.4 ELISA 收集細胞上清液或外周血，使用ELISA試劑盒檢測IFN-β或IL-6細胞因子的濃度。

1.2.5 熒光定量PCR 根據試劑說明，使用RNAiso plus試劑從細胞中提取總RNA。用逆轉錄酶逆轉錄形成單鏈cDNA。SYBR Green master Rox 用于定量實時逆轉錄酶-PCR 分析。qPCR 引物如下：VSV-G mRNA：正向5′-ACGGCGTACTTCCAGATGG-3′，反向5′-CTCGGTTCAAGATCCAGGT-3′；TNF-α mRNA：正向5′-AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3′，反向5'-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3'；IFN-β mRNA：正 向 5'-GGGAGAACTGAAAGTGGGAAA-3'，反 向5'-ACCTGCAAGATGTGGCAAAG-3'；β-actin mRNA：正向5'-GATGACGATATCGCTGCGCTG-3'，反向5'-GTACGACCAGAGGCATACAGG-3'。

1.2.6 Western blot 細胞用裂解緩沖液和蛋白酶抑制劑處理后，離心并收取裂解上清，用BCA 試劑盒測定上清中蛋白濃度。蛋白質在變性處理后，將其等質量的加入到十二烷基硫酸鹽-聚丙烯酰胺凝膠中，然后進行凝膠電泳和轉膜將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上，并在封閉液處理后，分別用以下的抗體和相應的二抗孵育。聚偏二氟乙烯膜上蛋白通過Pierce 化學發(fā)光ECL 試劑處理后，通過BIORAD Gel Doc XR 凝膠成像儀拍照獲取蛋白條帶?？贵w的稀釋比例如下：TBK1（D1B4；3504，1∶1 000）、IRF3（4962，1∶1 000）、p-IRF3（4D4G；4947，1∶5 000）、p-JNK（9251，1∶3 000）、JNK（9252，1∶1 000）、p-p65（3033，1∶3 000）、p65（8242，1∶1 000）、p-p38（9215，1∶3 000）和p38（9212，1∶1 000）。

1.3 統(tǒng)計學分析 本研究中的實驗至少獨立重復3 次。數據用表示，實驗各組數據之間的統(tǒng)計學比較采用Student'st-test，小鼠存活期實驗采用Kaplan-Meier 統(tǒng)計學方法進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫草素在小鼠體內抑制VSV 病毒感染 為了探索紫草素對小鼠病毒感染的影響，記錄了VSV 病毒感染后96 h 小鼠的生存率。在感染VSV 病毒后，對照組小鼠在12 h 開始死亡。相比之下，通過腹腔注射紫草素可以延長小鼠的存活時間并提高其生存率（20 mg/kg時為40%，40 mg/kg時為70%）（圖1A）。隨后，發(fā)現接受紫草素處理的小鼠肝、脾和肺組織中的VSV滴度和VSV-G mRNA水平明顯降低（圖1B、C）。H&E 組化實驗結果表明，VSV 病毒感染小鼠在紫草素處理后其肺組織結構的損傷和炎癥細胞的浸潤與對照組相比明顯減少（圖1D）。

圖1 紫草素在小鼠體內抑制VSV病毒感染Fig.1 Shikonin inhibits VSV infection in mice

2.2 紫草素在小鼠體內促進Ⅰ型干擾素的產生Ⅰ型干擾素在抗病毒天然免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用，因此本研究探討紫草素是否會影響Ⅰ型干擾素的產生。VSV 感染的小鼠，經紫草素處理后小鼠外周血中IFN-β 濃度與對照組相比顯著升高（圖2A），而IL-6 的濃度沒有明顯差異。評估小鼠肝、脾和肺組織中 IFN-β 的表達，發(fā)現 20 mg/kg 和40 mg/kg 的紫草素均能夠增加肝、脾和肺組織中IFN-β的表達（圖2B）。以上結果表明紫草素特異性增強小鼠RNA病毒感染中IFN-β的產生。

圖2 紫草素在小鼠體內促進Ⅰ型干擾素的產生Fig.2 Shikonin enhances production of type Ⅰinterferon in mice

2.3 紫草素抑制巨噬細胞中VSV 病毒的感染IFN-β 主要由巨噬細胞產生，為了進一步明確紫草素在病毒感染中的作用，用不同濃度的紫草素預處理巨噬細胞后并用VSV 病毒感染，發(fā)現低劑量（0.5 μmol/L）和高劑量（1 μmol/L）的紫草素均能降低VSV 病毒滴度（圖3A、B）。使用不同濃度的VSV（MOI=0.1 和1）感染巨噬細胞，結果顯示紫草素均能顯著抑制VSV-G mRNA 表達（圖3A、B）。隨后，用帶綠色熒光的GFP-VSV 感染細胞，通過流式檢測發(fā)現紫草素處理能夠顯著降低細胞GFP-VSV 的感染（圖3C）。這些數據表明紫草素能夠抑制巨噬細胞中VSV病毒的感染。

圖3 紫草素抑制巨噬細胞中VSV病毒的感染Fig.3 Shikonin inhibits VSV infection in macrophages

2.4 紫草素能夠促進Ⅰ型干擾素的表達從而抑制VSV 病毒的感染 為了進一步驗證紫草素對病毒的抑制作用是否由Ⅰ型干擾素介導，在體外檢測Ⅰ型干擾素和炎癥因子的產生。在VSV 感染不同時間點，觀察到紫草素處理后能夠顯著促進IFN-α和 IFN-β mRNA 的表達，而 TNF-α mRNA 沒有明顯差異（圖4A）。用不同濃度的病毒感染后，在紫草素作用下，均能增強IFN-α 和IFN-β mRNA 的表達（圖4B）。ELISA 結果表明 VSV 病毒感染后，IFN-β 蛋白水平在紫草素處理后能夠顯著增加，然而TNF-α 表達卻沒有明顯變化（圖4C）。利用Ⅰ型干擾素受體的阻斷抗體（IFNAR1 Ab）來阻斷Ⅰ型干擾素的信號通路，發(fā)現紫草素并不能抑制VSV 病毒的擴增和復制（圖4D、E）。上述結果表明，紫草素能夠促進Ⅰ型干擾素的表達從而抑制VSV病毒的感染。

圖4 紫草素能夠促進Ⅰ型干擾素的表達從而抑制VSV病毒的感染Fig.4 Shikonin inhibits VSV infection by promoting production of type Ⅰinterferon

2.5 紫草素促進VSV病毒誘導轉錄因子IRF3的活化 Western blot 結果表明，紫草素處理不會顯著調控p38、ERK、JNK、p65 和TBK1 的磷酸化，但可以顯著促進IRF3的磷酸化（圖5）。上述數據表明紫草素通過上調IRF3活化來促進IFN-β產生。

圖5 紫草素促進VSV病毒誘導轉錄因子IRF3的活化Fig.5 Shikonin promotes activation of IRF3 induced by VSV infection

3 討論

近期臨床研究顯示，中藥在新型冠狀病毒SARS-CoV-2感染引起COVID-19的治療中發(fā)揮著重要作用［15-16］。蓮花清瘟已被國家衛(wèi)生健康委批準用于COVID-19 的治療［17］。本研究也證明了中草藥紫草素在小鼠體內和體外均能抑制VSV 病毒感染。因此，推測紫草素也可能抑制SARS-CoV-2的感染。

以往研究發(fā)現，紫草素具有抑制炎癥、抗氧化以及抑制凋亡的作用［18-19］。在一些與炎癥和腫瘤相關的疾病中，紫草素可以通過抑制炎癥因子的釋放和氧化應激來減輕疾病的嚴重程度，如糖尿病視網膜病變以及乳腺癌、宮頸癌等［9，12-13］。本研究使用VSV 病毒來探究紫草素在宿主抗病毒中的作用，結果表明，紫草素可以在體內和體外保護宿主，抑制RNA 病毒感染，并且證明紫草素是通過上調巨噬細胞IFN-β來抑制病毒入侵。

以往研究發(fā)現紫草素能夠通過多種機制發(fā)揮其作用。如紫草素能夠抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路從而抑制腫瘤細胞的增殖和促進腫瘤細胞的凋亡［20］。紫草素能夠上調 P38、ERK 和 JNK 磷酸化，從而促進凋亡相關蛋白PARP 和Caspase-3 的表達，促進腫瘤細胞凋亡［21］。此外，紫草素也能夠誘導ROS 聚集，促進腫瘤細胞凋亡［22-23］。紫草素還能通過抑制TLR4 的表達抑制NF-κB 的信號通路，抑制炎癥因子的產生［24］。有文獻報道紫草素通過活化PI3K/AKT 信號通路緩解心肌缺血/再灌注損傷中的心肌細胞損傷［25-26］。本研究發(fā)現紫草素在病毒感染巨噬細胞后，能夠顯著上調轉錄因子IRF3的磷酸化水平，而沒有顯著改變NF-κB 信號通路的活化。IRF3 是Ⅰ型干擾素的關鍵轉錄因子。因此，紫草素是通過促進IRF3的活化，促進Ⅰ型干擾素的表達和抗病毒作用。尚需進一步研究紫草素對其他類型細胞的影響，包括除巨噬細胞外的其他天然免疫細胞、適應性免疫細胞、組織結構細胞等。

綜上所述，本研究結果顯示紫草素可以通過增強IRF3 活化，促進Ⅰ型干擾素的表達，來抵抗VSV病毒感染。結果表明紫草素是一種優(yōu)秀的、潛在的抗病毒候選藥物。