TRIM19通過調控p53信號促進卵巢癌進展的作用及機制研究①

王 琪 廖振蓉 羅德平 余 瑛 李 榮 （贛南醫學院附屬腫瘤醫院，贛州 341000）

卵巢癌是發達國家婦女癌癥病死的第五大原因，也是最致命的婦科惡性腫瘤［1-2］。由于卵巢癌早期無明顯癥狀、起病較隱匿，絕大多數患者初診時已經發生腫瘤的腹腔轉移和擴散，兩年內復發率達80%，五年生存率從45%下降到25%［3-5］。由于卵巢癌無癥狀特征，通常在晚期才被診斷出來。盡管其治療策略取得了重大進展，但仍是一種致命疾病，因此需要進一步研究以了解其發病機制和病理生理。TRIM（tripatite motif-containing protein）又稱為三基序蛋白，擁有環指結構域（RING-finger）、B-box結構域、卷曲螺旋coil-coiled）3 個特征性結構域，是一類發揮E3 泛素連接酶作用的蛋白家族［6］。研究發現，在不同腫瘤中，不同的TRIM 成員呈現差異性表達，可能通過與p53信號通路的相互作用，影響腫瘤因子表達，作為癌基因或抑癌基因調控腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等多種生物學過程，與腫瘤的發生發展密切相關［7］。

本研究檢測卵巢癌細胞中TRIM19 基因的表達，通過RNAi 技術降低TRIM19 的表達并觀察其對卵巢癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，同時初步探索TRIM19 基因是否通過p53 信號通路調控卵巢癌進程及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌細胞株SKOV-3、A2780、OVCAR3，人正常卵巢上皮細胞株 IOSE80（ATCC）；DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素（Sigma 公司）；TRIM19-siRNA、TRIM19、GAPDH 引物（安徽通用生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen）；RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量檢測試劑盒、CCK-8、DMSO、細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；TRIM19 抗體及GAPDH 抗體、HRP標記的IgG抗體（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 靶向TRIM19 基因的siRNA 合成及細胞轉染 委托安徽通用生物科技有限公司以化學法合成靶向敲減TRIM19 基因的siRNA，靶點序列為：5'-TGGATAACGTCTTTTTCGAGAGT-3'。以1×106個/孔將SKOV-3細胞接種于6孔培養板，無雙抗培養基培養，4 h 后當細胞融合到70%～80%時進行細胞轉染。按照 TRIM19-siRNA 2 μg/Lipo 8 μl、TRIM19-siRNA 4 μg/Lipo 8 μl 的濃度分別配制無血清培養液各100 μl，6 h后更換含10%FBS的DMEM培養基，24 h、48 h、72 h 后收集細胞備用。設轉染組（siTRIM19）、陰性對照組（NC），每組設3個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.2 熒光定量PCR（qPCR）檢測TRIM19 基因及信號分子表達 胰酶消化收集細胞，Trizol 裂解細胞，根據RNA 提取試劑盒說明書提取細胞中總RNA，置入RNA free 水內溶解備用。嚴格按照反轉錄試劑盒使用說明制備cDNA。以cDNA 為模板，GAPDH 為內參，SYBR Green 染料法檢測 TRIM19 及p53 信號分子表達。PCR 反應程序：95℃ 2 min，（95℃ 15 s、60℃ 15 s）40 個循環。每組設3 個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.3 Western blot 檢測 胰酶消化收集細胞，蛋白裂解液裂解細胞，4℃、14 000 r/min 離心10 min，提取細胞總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE 電泳膠，上樣、電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉，PBS 洗滌。一抗4℃過夜，PBS 洗滌。二抗室溫下孵育2 h，PBS 洗滌，ECL 試劑化學發光，顯影、定影。掃描膠片，凝膠圖像處理系統分析目標蛋白的灰度值。每組設3個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖能力 胰酶消化細胞，分別以 5 000 個/孔接種于 96 孔板，37℃、5%CO2培養24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 后加入10%體積的CCK-8試劑，繼續培養1～3 h后以酶標儀檢測450 nm處的吸光度值。每組設3 個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化細胞，以1 200 r/min 離心5 min，預冷的PBS 洗滌、離心，再以預冷PBS 重懸制成細胞混懸液。按照細胞凋亡檢測試劑盒使用說明用Annexin V染色法檢測細胞凋亡率。每組設3 個復孔，所有試驗均重復3次。

1.2.6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 將濾膜孔徑為 8 μm 的 Transwell 小室置于 24 孔板。胰酶消化并收集培養的細胞，以1×104個/孔接種于Transwell小室上室，下室加入 600 μl 含 20%FBS 的 DMEM 培養基。培養48 h 后取出小室，結晶紫染色，棉簽輕輕拭去小室濾膜上層的細胞。顯微鏡下觀察拍照，每個樣本隨機選取10 個視野拍照并計數。每組設3個復孔，所有試驗均重復3次。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件對數據進行分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TRIM19 在卵巢癌細胞中高表達 qPCR 結果表明，以人卵巢表皮細胞IOSE80 為對照，卵巢癌細胞 SKOV-3、A2780、OVCAR3 中 TRIM19 mRNA 表達量均顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.05）。如圖 1，SKOV-3 細胞中 TRIM19 比 IOSE80 細胞中上調5.05 倍，A2780 細胞中上調 1.75 倍，OVCAR3 細胞中上調1.84倍。

圖1 qPCR檢測TRIM19基因在卵巢癌細胞中的表達Fig.1 Expression of TRIM19 gene in ovarian cancer cells was detected by qPCR

2.2 TRIM19 被成功敲減 轉染靶向TRIM19 基因的siRNA（siTRIM19）并培養48 h 后，轉染組TRIM19基因的mRNA 表達量較對照組（NC）降低約69.3%（圖2A），TRIM19 蛋白表達量較對照組（NC）降低約51.8%（圖2B），差異具有統計學意義（P＜0.05）。因此，卵巢癌細胞SKOV-3中TRIM19基因被成功敲減。

圖2 SKOV-3細胞中的TRIM19基因被成功敲減Fig.2 TRIM19 gene was knocked down successfully in SKOV-3 cells

2.3 TRIM19 調控卵巢癌細胞增殖 敲減TRIM19基因后，細胞增殖能力明顯減弱，在第5 天時，轉染組細胞增殖率是對照組的25.8%（圖3A）。同時，細胞克隆形成能力明顯減弱。在第14天時，經結晶紫染色后計數細胞發現轉染組中細胞克隆數只有約52 個，而對照組中克隆數量接近368 個（圖3B、C）。提示TRIM19 基因對卵巢癌細胞的生長及增殖有重要貢獻。

圖3 敲減TRIM19基因抑制SKOV-3細胞增殖與生長Fig.3 Knockdown of TRIM19 gene inhibited proliferation and growth in SKOV-3 cells

2.4 TRIM19 調控卵巢癌細胞侵襲 轉染組中可穿透小室上層阻隔膜的SKOV-3 細胞數量較對照組明顯增加。經統計，敲減TRIM19后，細胞穿透能力約降低70%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。提示敲減TRIM19 基因可明顯抑制卵巢癌細胞SKOV-3的侵襲行為。

圖4 敲減TRIM19抑制SKOV-3細胞侵襲Fig.4 Knockdown of TRIM19 suppressed cell invasion in SKOV-3 cells

2.5 TRIM19 調控卵巢癌細胞凋亡 敲減TRIM19基因并培養48 h 后，轉染組中細胞凋亡率為12.5%，對照組中細胞凋亡率為0.45%，轉染組凋亡率是對照組的30倍，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖5）。提示敲減TRIM19 基因明顯促進卵巢癌細胞SKOV-3凋亡。

圖5 敲減TRIM19誘導SKOV-3細胞凋亡Fig.5 Knockdown of TRIM19 induced cell apoptosis in SKOV-3 cells

2.6 TRIM19 調控 p53 信號通路 敲減 TRIM19 基因后，SKOV-3 細胞凋亡率明顯上調，提示TRIM19協助SKOV-3 細胞抵抗凋亡。為探明TRIM19 基因是如何抗凋亡的，以qPCR 技術檢測多個凋亡相關信號分子表達。如圖6，敲減TRIM19 基因后，細胞中p53、p21、CyclinD、CDK2、Bax 基因表達量分別提高 2.83、3.7、2.79、4.94、6.1 倍。 當 同 時 下調SKOV-3 細胞中的 TRIM19 基因與 p53 基因后，細胞中p53、p21、CyclinD、CDK2、Bax 表達量比對照組略有提高，但差異無統計學意義。因此，在卵巢癌中，TRIM19調控p53信號通路，抵抗凋亡行為。

圖6 qPCR檢測p53相關信號分子表達Fig.6 Expressions of p53-related molecules detected by qPCR

3 討論

卵巢癌是嚴重威脅全球女性健康及生命安全的致命因素。抽樣調研表明在我國每年死于卵巢癌的女性接近2.3 萬例，且每年新增約5.6 萬例卵巢癌病患［8］。然而當前治療卵巢癌的主要策略是手術結合放化療，對晚期患者療效甚微。二代基因組測序發現大部分癌癥患者遺傳基因發生變異，而這些變異正是誘導正常細胞癌變的關鍵因素。更不幸的是，包括卵巢癌的絕大部分癌癥均具有異質性特征，每個亞群甚至每個患者的關鍵致病基因均可能不同。例如，MDC1 可促進卵巢癌細胞增殖和遷移［9］；過表達PinX1 基因抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲能力［10］。大量研究揭示癌癥的遺傳異質性是導致臨床上不同個體對同一個治療方案或藥物產生差異反應的關鍵因素，發掘關鍵致病基因是當前精準醫療、細胞免疫治療面臨的最大挑戰。

TRIM19，又 稱 PML（promyelocytic leukemia protein），屬于TRIM（protein of triple motif）家族，主要在細胞核中表達，在細胞核中形成被稱為PML 核體的動態結構，是一種早幼粒細胞白血病蛋白［11］。TRIM19 最早被發現能夠干擾許多病毒，包括人類免疫缺陷病毒、人泡沫病毒、脊髓灰質炎病毒、流感病毒、狂犬病毒、腦心肌炎病毒、腺相關病毒和水泡性口炎病毒的復制［12-17］。在部分腫瘤的發生發展過程中，作為抑癌基因，TRIM19 負向調控腫瘤的DNA損傷修復、增殖、分化、凋亡、侵襲等過程［18］。在前列腺腺癌、結腸腺癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、中樞神經系統和生殖細胞腫瘤中，TRIM19 蛋白表達完全或部分喪失，并與腫瘤的分級及分期密切相關［19］。在乳腺癌中，PML 表達隨病變進展而下調，且與腫瘤大小、淋巴結轉移狀態及pTNM 分期顯著相關；生存曲線分析顯示，PML 蛋白表達水平是影響乳腺癌預后的獨立因素，其表達水平越高，患者無病生存期越長［20］。在乳腺癌和造血干細胞中，細胞水平過表達PML 能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞周期阻滯、老化及細胞凋亡［21-22］。然而，每個基因在不同的腫瘤中可能發揮不同作用。在卵巢癌細胞中，沉默PML表達抑制腫瘤細胞的增殖及誘導DNA損傷［23］。

本研究發現TRIM19 在卵巢癌細胞SKOV-3、A2780、OVCAR3 中表達較人卵巢表皮細胞IOSE80表達量明顯增高。敲減TRIM19 后，SKOV-3 細胞增殖能力降低，侵襲能力明顯減弱。相反，敲減TRIM19 明顯促進卵巢癌細胞SKOV-3 凋亡。本研究進一步證實TRIM19 基因在卵巢癌生長及轉移中發揮致癌作用，同時本研究初步闡釋了TRIM19 基因誘發卵巢癌的分子機制。

p53 是一種重要的腫瘤抑制因子，作為一種轉錄因子，選擇性地轉錄其靶基因，調控多種細胞應激反應，發揮其抑制腫瘤的功能。TRIM 與p53 在抗腫瘤作用中相互調控，許多TRIM 是p53的負或正調控因子，同時許多 TRIM 被 p53 調控，介導 p53 在細胞應激反應和腫瘤抑制中的功能。很多帶有Ring結構域的TRIM 可以與p53 結合，如TRIM24、TRIM39、 TRIM32、 TRIM59、 TRIM31、 TRIM71、TRIM69 和TRIM23，導致p53 泛素化和降解。另外，部分編碼TRIM 的基因是p53 的直接靶基因，p53 能夠 轉 錄 調 節 TRIM3、TRIM8、TRIM19、TRIM22、TRIM24、TRIM32、TRIM67和TRIML2［7］。本研究中，敲 減 TRIM19 基因 后，qPCR 檢測 發現 p53、p21、CyclinD、CDK2、Bax 表達增加，提示敲減 TRIM19 可能激活p53 依賴的凋亡信號通路，促進腫瘤細胞的凋亡。然而，TRIM19 與p53 信號是如何聯系的，二者之間的介導分子是什么？TRIM19 對卵巢癌細胞體內生長的作用是什么？這些問題需要更深入的研究，也是課題組后期的研究計劃。

本研究證實，TRIM19基因在卵巢癌細胞SKOV-3、A2780、OVCAR3 中高表達。敲減 TRIM19 可明顯抑制卵巢癌細胞SKOV-3 增殖、侵襲能力并促進凋亡。機制研究表明TRIM19 可調控p53 依賴的凋亡信號通路。因此，TRIM19 具有成為卵巢癌治療的新靶點潛力，課題組將繼續研究TRIM19 對卵巢癌的發病及轉移的作用及深層分子機制。