TLR7基因單核苷酸多態性與江蘇淮安哮喘患者易感性的相關性研究①

邢 飛 周 瑾 姜玉新 金 躍 （徐州醫科大學附屬淮安醫院醫學檢驗科，淮安 223002）

支氣管哮喘以慢性氣道炎癥、氣道高反應性和可逆性氣流受限為特征。主要涉及肥大細胞、T 淋巴細胞、嗜酸性粒細胞。在臨床上，其傾向于出現反復呼吸困難、喘息、咳嗽和胸部不適等癥狀。據不完全統計，全球約有3.34 億人口罹患哮喘，每年約有18 000 人死于哮喘［1］。經典理論認為，Th1/Th2失衡是支氣管哮喘發病的重要免疫機制。迄今為止，許多研究評估了基因變異和哮喘易感性間的關系。Toll 樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）在各種免疫細胞中表達，包括抗原呈遞細胞和首次遇到傳入病原體的細胞（如上皮細胞），特別是樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）在初始病原體感測和免疫應答的啟動中發揮重要作用。DCs 是否促進Th1 或Th2 狀態（以不同的細胞因子為特征）在很大程度上取決于觸發TLR 的方式，而這種方式又取決于感染的類型［2-3］。TLR7 為 TLRs 家族成員，主要識別病毒單鏈RNA，通過MyD88信號途徑誘導產生干擾素及核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）介導的免疫反應，誘導 IFN-β 等炎癥細胞因子表達［4］。單個基因的異?？蓪е抡麄€TLR7 信號通路缺陷，研究證實TLR7 位點多態性與多種免疫性疾病易感性相關［5］。本研究采用病例對照研究方法，探討TLR7單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與哮喘發病危險度的相關性。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 哮喘患者158例設為哮喘組，患者均為2018 年3 月至2020 年10 月淮安市第二人民醫院收治的門診和住院患者，均為淮安市常住人口（≥10 年），年齡16～75 歲，平均為（44.94±19.51）歲。所有患者均符合中華醫學會呼吸分會哮喘學組制定的哮喘診斷標準（2008 年修訂）；健康志愿者137 例設為對照組，均為徐州醫科大學附屬淮安醫院體檢中心各項指標正常的人群，年齡13～65歲，平均為（33.57±15.31）歲，均無過敏性疾病癥狀或心血管病史。人口一般特征統計見表1。以上所有研究對象均簽有知情同意書。

表1 哮喘組與對照組人口統計學特征Tab.1 Demographic characteristics of asthmatic and control group

1.1.2 主要試劑 人類基因組提取試劑盒及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及DNA 提取 采集受檢者外周靜脈血2 ml，用人類基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 引物的設計及合成 根據網絡數據庫（NCBI）及Hapmap數據庫公布的人類DNA 核酸序列設計特異性引物（表2），送至生工生物公司合成。

表2 3個位點的基因序列Tab.2 Gene sequences of three loci

1.2.3 PCR 擴增 反應體系 50 μl；模版3 μl，引物1 μl，dNTP 1 μl，10×Buffer 5 μl，Tap 酶 0.5 μl，雙蒸水 34.5 μl，MgCl24 μl；反 應條件：95℃ 預變性5 min，94℃ 變性40 s，56℃ 退火30 s，72℃ 延伸40 s，35 個循環，最后 72℃ 延伸 5 min。取 5 μl PCR 產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳25 min，在SyngeneG：BOX熒光凝膠成像系統下分析。

1.3 統計學處理 運用SPSS24.0統計軟件進行分析。正態分布的定量資料以表示，兩樣本均數的比較采用t檢驗?；蝾l率采用基因計數法計算，使用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢測樣本可靠性。組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗，并計算OR值和95%CI。不同基因位點多態性對哮喘相對危險度采用單變量Logistic 回歸分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢測 哮喘組和對照組進行Hardy-Weinberg平衡檢測結果顯示樣本均符合Hardy-Weinberg 遺傳規律（P＞0.05，表3），說明研究樣本可進行后續分析。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢測結果Tab.3 Hardy-Weinberg test results

2.2 基因型頻率和等位基因頻率比較 對rs179009、rs179019、rs5935436 位點在哮喘組與對照組中基因型頻率和等位基因頻率分布比較顯示見表4、表5。在江蘇淮安地區漢族人群哮喘組rs179009基因型分布與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），等位基因G 高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。而rs5935436 位點基因型分布與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），等位基因C 與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。rs179019位點基因型分布與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.05），且等位基因C 與正常對照組相比，結果亦有統計學意義（P＜0.05）。

表4 哮喘組與對照組TLR7各位點基因頻率分布［例（%）］Tab.4 Frequency distribution of TLR7 gene each loci genotypes in asthma and control group［n（%）］

表5 哮喘組與對照組TLR7 各位點等位基因頻率分布［例（%）］Tab.5 Frequency distribution of TLR7 gene each loci alleles in asthma and control group［n（%）］

2.3 基因型相對危險度 如表6 所示，rs179009 基因位點相對GG 基因型而言，AA 與GA+AA 基因型均能增加哮喘發生的危險性，而GA 基因型與哮喘發病無相關性；rs179019基因位點相對CC基因型而言，AA與CA+AA基因型，亦能增加哮喘發生的危險性，而CA 基因型未發現與哮喘發病有相關性；rs5935436基因位點CT、TT型及CT+TT較CC型差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表6 各位點不同基因型對哮喘的相對危險度Tab.6 Relative risk of asthma for different genotypes at each loci

3 討論

哮喘是一種復雜的疾病，涉及多種物質（例如細胞因子）的細胞分泌及其他多種因素影響。其中遺傳因素和環境因素間的相互作用可導致各種并發癥的發生，以反復發作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶為主要特征，發病率逐年增高［6］。在臨床實踐中確定患者對哮喘的超敏水平至關重要。

TLR 是目前發現的一種模式識別受體，能夠特異性識別細菌、病毒等多種病原微生物，進而激活機體對病原微生物的非特異性免疫應答［7］。其受體家族（TLRs），尤其是 TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 是啟動固有免疫應答的重要分子，發揮重要的抗病毒效應功能［8］。人類TLR7 基因位于性染色體Xp22上，TLR7 介導機體抗病毒免疫，在天然和獲得性免疫中發揮重要作用。支氣管哮喘是以Th2應答為主的免疫失衡，激活TLR7 信號途徑導致NF-κB 活化及促炎因子（如IFN-α、TNF-α和IL-12）分泌，進而使免疫應答偏向 Th0 甚至 Th1 方向［9］。既往多項研究表明，TLR7 激動劑可防止Th2 介導的氣道炎癥中卵清蛋白誘導小鼠發生哮喘［10-13］。TLR7 信號轉導的作用不僅限于Th2定向炎癥的動物模型。近期有報道稱哮喘患者青少年TLR7 功能減弱，哮喘患者中由鼻病毒（TLR7的天然配體）誘導的干擾素缺乏，但在控制良好的哮喘患者中沒有TLR7 功能減弱［14-15］。以上研究表明TLR7 在哮喘的發病機制中發揮關鍵作用。國內外TLR7 基因位點rs179007 多態性集中在肝臟免疫疾病的研究。ZHU 等［16］研究發現TLR7基因多態性在中國成年人慢性乙型肝炎感染進展中發揮重要作用，并且可能部分解釋了中國男性中HBV相關疾病高發病率的原因。FAKHIR 等［17］研究發現 TLR7 基因 rs179008-T 和 rs179009-G 等位基因在男女中均增加了HCV 疾病進展的風險。而M?LLER-LARSEN 等［18］研究發現 TLR7 和 TLR8 相關的4種表型（哮喘、鼻炎、特應性皮炎和特異性IgE均升高）中，TLR7和TLR8的SNP與單倍型均存在顯著關聯。哮喘發病與TLR7 基因位點rs179008 多態性具有較強的相關性。TORMANEN 等［19］研究發現TLR7 基因位點rs179008 多態性可能增加嬰兒毛細支氣管炎后學齡前兒童患哮喘的風險。而ZHANG等［20］在研究 TLR7 和 TLR8 多態性與中國漢族人群哮喘發病相關性時發現TLR7 和TLR8 基因多態性可能在哮喘的發病機制中起重要作用，其中rs179009 基因位點與哮喘患者FEV1%及哮喘嚴重度相關。SHAN 等［21］研究發現，與健康志愿者相比，哮喘患者中TLR7 rs179009 基因型頻率更高，與本研究結果基本一致。本研究發現TLR7 基因位點rs179009與江蘇淮安地區漢族哮喘顯著相關。而對于rs179019 位點研究多集中在其他免疫疾病方面。KAWASAKI 等［22］發現 TLR7 內含子 SNP rs179019 和系統性紅斑狼瘡相關，在亞洲人群系統性紅斑狼瘡中有易感性。RAAFAT等［23］研究發現rs179019多態性在系統性紅斑狼瘡患者和對照組間的基因型分布無統計學差異。ZHANG等［24］研究發現TLR7基因rs179019位點的A等位基因不是嚴重手足口病的危險因素。YUE 等［25］確定了 TLR7（rs179019/rs3853839）C 等位基因與中國女性HCV 的發生有關，CC 型和AC 型單倍型具有針對中國女性的HCV 持久性的保護作用。BARBARASH 等［26］發現 TLR7 中 rs179019位點與廣東女性患Graves 病的風險增加有關。本次研究發現rs179019 位點多態性與江蘇淮安哮喘患者發病相關。TLR7基因rs5935436位點與免疫性疾病相關性研究相對較少，TRAKS 等［27］發現 TLR7 SNP rs5935436、rs179013 和 rs179008 區域在整個白癜風及其亞組分析中產生了較弱的等位基因關聯。ZHANG 等［20］發現 rs5935436SNP 的 T 等位基因對男性哮喘的發展有保護作用。rs5935436 的CT/TT 基因型在患有過敏性鼻炎的女性哮喘患者中偶爾出現。SHAN 等［21］發現 TLR7 基因 rs5935436 的啟動子區域SNP 與慢性阻塞性肺疾病和非小細胞肺癌的風險均相關。SHAN 等［21］研究表明 TLR7 rs5935436位點SNP 與小兒哮喘間不存在顯著相關性，與本研中TLR7 rs5935436 位點與淮安漢族人群哮喘發病無相關性的結論一致。

綜 上 ，TLR7 基 因 位 點 rs179009、rs179019 和rs5935436 多態性與各類免疫系統疾病相關性不盡相同，提示種族差異和遺傳背景的不同可能會影響TLR7 基因多態性在免疫疾病遺傳機制中的作用。本研究表明TLR7 基因3 個位點多態性在哮喘易感基因中表現亦不同，這可能與哮喘發病的復雜性有關?？傊煌貐^人群的基因SNP 與同一疾病的相關性不同，今后需選取更大樣本，更多人群，多種族開展研究，以便為哮喘的治療提供可靠依據。