MicroRNA在膽囊癌發病機制及診斷價值的研究進展*

李 壯 張 鵬 孫艷軍 盛明輝 王文飛 孫登群,

1 安徽中醫藥大學第一臨床醫學院，安徽省合肥市 230022； 2 武警安徽省總隊醫院普外科

膽囊癌(Gallbladder cancer,GBC)是一種常伴有局部浸潤、早期廣泛的淋巴結轉移和多發性遠處轉移的侵襲性疾病。由于沒有具體的臨床體征、癥狀或可靠的敏感標記，出現的癥狀常被誤診為膽絞痛或慢性膽囊炎，進一步延誤診斷。對于晚期GBC患者，需要聯合化療、放療、靶向治療和免疫治療，以提高患者的總生存率，通常晚期患者因癌細胞遠處轉移難以根治性切除而療效欠佳,故其患者總體預后極不理想。因此識別新的生物標志物對于GBC患者的早期診斷和有效治療至關重要。據資料顯示microRNA能調節人類1/3的基因，microRNA與腫瘤細胞的發生亦有非常密切的關系，許多研究發現改變miRNAs的表達與癌癥進展有關，其中包括GBC[1]。因此深入探尋miRNA對GBC發生發展的相關性對突破現階段GBC的診療治療有重要意義。

1 MicroRNA 的概述

MicroRNAs(miRNAs)是一種短的(19～25個核苷酸)非編碼RNA，起著基因表達的主要調節作用，調節人類1/3的基因[2]。到目前為止，被鑒定出的miRNA已經高達上萬個，并被證明參與調節各種生物學過程以及眾多的發育和生理過程。這些基因主要通過與靶mRNA的3’非翻譯區(UTR)結合，作為轉錄后基因表達的負調控因子，從而要么在轉錄上破壞/降解，要么抑制(或兩者兼而有之)，這取決于miRNA-mRNA的互補程度[3]。

一般來說，miRNAs參與了重要基因的轉錄調控，這些基因控制著腫瘤發生和發展中的關鍵信號通路，如凋亡、細胞增殖、血管生成和微環境的調節。各種研究表明miRNAs基因調控影響與多種信號通路有關，如p53、HIF-1α、RAS、AKT、AMPK和cMyc等導致癌癥代謝缺陷的信號通路。研究還發現，miRNA在人類腫瘤中的表達普遍下調，而一些研究也報道了miRNA在癌癥中的過度表達[4]。此外，研究發現miRNA既可以作為癌基因，也可以作為腫瘤抑制因子。由于miRNA在體液中穩定表達,且檢測miRNA水平日趨精準，miRNA的表達有助于作為癌癥患者診斷、預后和治療選擇的新的腫瘤生物標志物[5]。

2 MicroRNA調控相關通路參與膽囊癌的發病

膽囊癌的形成是一個多階段的過程，在接觸致癌物后，正常膽囊上皮由化生到異型增生再到原位癌，最后轉化為浸潤性癌。整個致癌過程是緩慢的，可能需要長達15年的時間。在分子水平上，惡性轉化是由于某些基因突變隨時間聚集而發生的，因此原癌基因和抑癌基因、不同的信號通路等多方面下影響著膽囊癌的進展。

2.1 PTEN/PI3K/Akt信號通路 PTEN是一種具有脂質和蛋白雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制因子，可負向調節AKT信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖與遷移，且PTEN/PI3K/AKT信號通路參與調控多種腫瘤細胞遷移與侵襲[6]。Chen等[7]研究發現腫瘤細胞中miR-205、miR-122、miR-21的表達能夠抑制PTEN的表達，促進腫瘤的增殖、生長和轉移。miR-99a-5p在膽囊癌患者組織中普遍低表達，體內體外實驗證明過表達miR-99a-5p能使Akt蛋白的酸磷化水平下降，抑制PI3K/Akt信號通路[8]。Xuan等[9]探討了ORA(黃芩素A)對PTEN/PI3K/AKT信號通路的影響，發現ORA可抑制PTEN/PI3K/AKT信號通路，進而影響膽囊癌GBC-SD的進展。進一步研究證明ORA在體內能抑制膽囊腫瘤的生長。這些結果表明ORA可能在不久的將來成為一種潛在的抗腫瘤藥物用于人類膽囊癌的治療。

2.2 c-FLIP信號通路 c-FLIP是一種重要的參與細胞凋亡的抑制蛋白，Zong等[10]研究發現miR-125b在膽囊癌組織中的表達明顯降低，miR-125b的表達與膽囊癌的分級顯著相關(P=0.036 1)。miR-125b通過與c-FLIP mRNA的3’端非編碼區相互作用而抑制c-FLIP的表達從而起到抑制膽囊癌細胞的生長，揭示了miR-125b-c-flip信號在膽囊癌細胞生長中的重要作用。c-FLIP豐富了miR-125b的靶基因通路，有望成為治療GBC的新靶點。

2.3 Notch信號通路 研究發現，Notch信號異常與惡性腫瘤的發生發展有著廣泛而密切的關系，并可根據組織或細胞類型的不同具有致癌或腫瘤抑制功能。已確定4個Notch受體(Notch 1～4)和5個Notch配體在Notch信號通路中發揮作用[11]。Hua等[12]研究表明miR-1-5p在膽囊癌組織中的表達明顯低于非腫瘤組織，體外實驗表明miR-1-5p可抑制膽囊癌細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲。miRNAs通過抑制靶基因的表達發揮其關鍵作用，Notch2是miR-1-5p的直接靶基因，miR-1-5p通過靶向Notch2的表達在膽囊癌細胞中發揮腫瘤抑制作用，并為miR-1-5p/Notch2信號在人膽囊癌細胞生長、遷移和侵襲中的精確表達提供了分子基礎。

2.4 ANGPT2信號通路 Diao等[13]通過免疫組織化學和逆轉錄—定量PCR檢測發現miR-135a-5p在GBC組織中表達下調, 過表達顯著抑制GBC-SD細胞的增殖和遷移。從熒光素酶活性檢測發現血管生成素-2(ANGPT2)是GBC中miR-135a-5p的潛在靶基因，抑制ANGPT2表達可顯著抑制膽囊癌的增殖、遷移和侵襲。因此miR-135a-5p可能是GBC進展的潛在生物標志物和GBC治療干預的潛在靶點。

2.5 JAK/STAT信號通路 信號轉導和轉錄激活因子(STAT)被Janus激酶(JAK)磷酸化、二聚化，然后通過核膜轉運到細胞核，調節相關基因的表達。該通路被稱為Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK/STAT)信號通路，又稱IL-6信號轉導通路，是近年來發現的一種細胞因子刺激的信號轉導通路。該信號通路與多種機體功能相關，并參與一些重要的生物學過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、免疫調節。Ishigami等[14]研究發現miR-31在膽管癌組織中的高表達，miR-31高表達與預后顯著相關(P=0.043)，miR-31在腫瘤組織中表達上調，它不僅促進細胞增殖，而且抑制凋亡。IL-6受體是信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)的強誘導因子，lL-6的STAT3信號是癌細胞增殖和存活的重要促進劑。miR-31的靶基因位點STAT-3結合位點，抑制STAT-3信號轉導顯著抑制miR-31的表達和細胞增殖。結論：IL-6-STAT-3信號轉導調控膽管癌細胞增殖和miR-31表達,提示miR-31可能是一個很有前途的生物標志物。

2.6 EMT信號通路 上皮細胞—間充質轉化(Epithelial-tomesenchymal transition，EMT)是介導包括膽囊癌在內的多種癌癥惡變的關鍵步驟，miRNA可以通過抑制EMT發揮抑癌作用。Lu等[15]研究發現在膽囊癌組織中miR-7-2-3p和miR-29c-3p的水平明顯降低，miR-7-2-3p和miR-29c-3p的過表達明顯削弱了癌細胞的遷移和侵襲能力。實驗檢測膽囊癌細胞中miR-7-2-3p和miR-29c-3p的Vimentin表達降低，E-cadherin表達增強。MiR-7-2-3p和miR-29c3p過表達通過逆轉EMT表型，在體內外抑制GBC轉移。Cui等[16]采用定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)方法檢測發現miR30-b和miR-30d在膽囊癌組織中的表達水平均低于正常膽囊組織。miR-30b模擬、miR-30d模擬和miR-30b/-30d模擬引入GBC-SD細胞，并檢測了EMT特異性標記物E-cadherin、N-cadherin和visionin的表達，這在miR-30b模擬、miR-30d模擬和miR-30b/-30d模擬處理的人GBC細胞中表現為E-cadherin增強，N-cadherin和vientin減少。結果提示miR-30b/-30d 能夠抑制GBC-SD的EMT和侵襲遷移。

3 MicroRNA誘導基因受體在膽囊癌中的作用機制

除了通路改變外，miRNA表達失調可能源于腫瘤抑制因子或致癌因子的改變，這些腫瘤抑制因子或致癌因子作為轉錄激活因子或抑制因子在腫瘤性疾病的起始、進展和轉移中起到致癌基因或抑癌基因的作用。

3.1 miRNA致癌的作用機制 Tong等[17]發現與鄰近組織相比，膽囊癌組織中miR-197高表達，下調增殖相關蛋白p-ERK1/2和p-AKT的表達，上調凋亡途徑相關蛋白Bax/Bcl-2和c-caspase-3的表達，從而促進了膽囊癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Song等[18]研究發現miR-552-3p在膽囊癌組織中表達上調，miR-552-3p在體內外實驗證明可促進GBC細胞的增殖、遷移和侵襲。重要的抑癌基因RGMA被確定為miR-552-3p的靶點，miR-552-3p通過直接靶向RGMA的3’-UTR區域，負調控GBC中RGMA的表達。miR-552-3p通過抑制腫瘤抑制基因RGMA，導致Akt/β-catenin和EMT信號通路的重新激活而促進膽囊癌的惡性進展。miR-552-3p可作為GBC患者預后的預測指標和治療靶點。

3.2 miRNA抑癌的作用機制 文獻[4]報道miRNA可通過調節下游特定靶基因抑制腫瘤細胞侵襲和增殖。Gong等[19]研究發現miR-1231在膽囊癌組織中的表達水平低于癌旁組織。miR-1231低表達的GBC患者腫瘤分期差，腫瘤體積較大，過表達降低了GBC細胞的增殖能力，miR-1231抑制GBC增殖并誘導其凋亡。miRNAs和靶基因之間相互作用可以影響病理進展，經測定FOXC2為miR-1231結合靶基因，FOXC2水平被負調控，miR-1231通過下調FOXC2，從而減輕GBC的惡性發展。Jiang等[20]研究發現miR-365在膽囊癌組織中表達下調，抑制膽囊癌細胞的生長、轉移和自我更新，實驗結果表明miR-365在膽囊癌中可能起到抑癌作用。Li等[21]研究發現miR-188-5p在膽囊癌組織中表達下調，miR-188-5p過表達可誘導GBC細胞凋亡,同時miR-188-5P抑制劑轉染后凋亡細胞減少。在總體生存期方面，miR-188-5p低表達患者的預后明顯差于miR-188-5p高表達患者。劃痕實驗轉染miR-188-5p的NOZ細胞侵襲細胞數量減少，而miR-188-5p下調則增強了GBC-SD細胞的侵襲能力。這些數據表明miR-188-5p具有抗腫瘤特性，可以抑制GBC的遷移和侵襲。

4 MicroRNA在診斷評估膽囊癌中的相關研究

microRNA在膽囊癌診斷和預后評估中具有重要的價值意義。血清等標本容易獲取，且其中的miRNA穩定，因此為miRNA作為膽囊癌的一種腫瘤標志物進行臨床檢測提供了可能性。Li等[22]通過比較GBC組織和癌旁正常組織中miRNAs的差異表達，使用MiRNA微陣列分析評估40例膽囊癌患者外周血樣本中全基因組miRNA的表達，進一步在血漿中驗證miRNA21、miRNA187、miRNA143、miRNA202、miRNA335、let7a在膽囊癌患者血漿中的表達異常，對膽囊癌診斷具有重大臨床意義，對制定治療方案和預后判斷起到重要作用。血漿中miRNA特異表達譜可能是診斷膽囊癌一類新的血液腫瘤標志物,通過對血漿中特異性miRNA表達譜的檢測來早期診斷膽囊癌，評估其轉移和復發，可以彌補癌胚抗原(CEA)和糖類抗原19-9(CA19-9)早期診斷敏感性低的不足。Gupta等[23]評估了GBC中分子標記物的表達，實驗證明p53是最常見的陽性標記占74%，survivin占58%，COX-2(Cyclooxygenase-2)占44%，p16占42%，而Her 2-neu(Human epidermal growth factor receptor 2 )和EZH-2(Enhancer of zeste homolog-2)各占16%，不同分期的p16和p53分布差異有統計學意義(χ2= 7.017,P= 0.037；χ2= 5.861,P= 0.033)。研究結果提示GBC中存在Her 2-neu、p53、p16、survivin、COX-2、ezh-2等分子標志物的表達，今后可用于疾病的早期檢測和靶向治療。膽汁是膽管上皮細胞賴以生存的微環境，在脂肪代謝中發揮重要的作用。有研究顯示，膽汁外泌體中miR-191、miR-486-3p、miR-1274b、miR-16和miR-484 5種miRNA可作為膽管癌診斷組合，靈敏度和特異度分別為67%和96%，優于血清糖類抗原19-9(CA19-9)檢測[24]。膽汁外泌體在疾病診斷中發揮重要作用，相對于其他體液，有關膽汁外泌體的研究較少，外泌體中所含遺傳信息及其相關作用機制有待進一步深入。

此外，有研究結果鑒定microRNA可作為膽癌患者診斷和預后評估的生物標志物是有應用前景的。Wang等[25]使用微陣列技術來鑒定長期或短期生存的GBC患者中調節異常的miRNAs。與正常膽囊癌組織相比，長期生存的GBC患者癌組織中有104個miRNAs表達異常，短期生存的GBC患者癌組織中有124個miRNAs表達異常。隨后通過Venn圖分析，發現只有hsa-miR-142-5p和hsa-miR-146b-5在長期生存的GBC患者中表達下調，而22個miRNAs在短期生存的GBC患者中完全表達異常，說明這些miRNAs可能與GBC患者的生存有關，提示它們可能是診斷膽囊癌預后的新指標。這些臨床對照研究實驗證實，miRNA在膽囊癌患者與健康人群之間存在顯著差異性表達，這為miRNA成為膽囊癌潛在診斷標志物奠定了理論基礎。

5 小結與展望

膽囊癌的發病率近幾十年來呈上升趨勢，迫切需要研究新的診斷和預后生物標記物以及確定膽囊癌的潛在發病機制。目前miRNA已在多種腫瘤中發現其異常表達，要弄清miRNA在膽囊癌中的價值，還需要通過進行更多的相關研究來進一步探索它們。因此，在后續的研究中，筆者將繼續關注miRNA在膽囊癌中的相關研究進展，以證實其臨床應用的可靠性。