CD8+CD25+調節性T細胞在疾病中的研究進展

文李娜，陳 麗，段 瑞，李 芳

(山西醫科大學第二臨床醫學院 風濕免疫科， 山西 太原 030000)

1 CD8+CD25+Treg分型和作用機制

調節性T細胞(regulatory T cells,Tregs)在外周免疫耐受性的產生和維持中起著重要作用[1]。Tregs數量和/或功能的缺陷可能是人類自身免疫性疾病的潛在原因，而Tregs的過度豐富又會阻礙對癌或病原體的免疫力。CD8+CD25+調節性T細胞作為Treg亞群之一，與CD4+CD25+Treg一樣，在維持機體免疫耐受和調節免疫反應中起著重要作用，雖然在外周血中CD8+CD25+Treg的比例甚少，但它的調節作用遠遠超過了CD4+CD25+Treg[2]。

從其產生的方式來說，CD8+CD25+Treg可分為天然型和誘導型。天然型CD8+CD25+Treg存在于人的胸腺中， 與CD4+CD25+人胸腺細胞有著相似的定位、表型、功能及作用機制[2]。在主要組織相容性復合體 (major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ類基因缺陷的小鼠中也發現了具有調節特性CD8+CD25+T細胞，它們經活化后不產生細胞因子，但多表達表面CTLA-4、GITR和Foxp3，通過細胞接觸機制來表達抑制活性。誘導型的CD8+CD25+Treg可通過抗原刺激誘導產生，除了一些普通抗原外，IL-6、TGF-β、IL-33也可誘導CD8+CD25+Treg細胞的產生，通過CTLA-4介導的細胞間接觸、誘導抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell, APC)產生耐受表型、產生細胞因子如TGF-β和IL-10等多種機制發揮免疫抑制作用。對CD8+CD25+Treg進行研究將有助于深入探索不同疾病的免疫抑制機制，為疾病的免疫生物治療提供依據。

2 CD8+CD25+Treg在疾病的變化及作用機制

2.1 CD8+CD25+Treg與惡性腫瘤

在腫瘤免疫中，Treg細胞除了免疫調節外，還參與了腫瘤的免疫逃逸導致腫瘤發生和復發[3]。

2.1.1 大腸癌(colorectal cancer,CRC)： Treg細胞在CRC發展過程中有腫瘤促進作用，去除Treg細胞可以引起抗腫瘤反應。CRC患者血液及組織中CD8+CD25+FoxP3+Treg(CTLA-4+、GITR+)水平升高，繼而產生TGF-β1，促進腫瘤進展。TGF-β1在CRC的作用已有報道：在CRC晚期，TGF-β1通過控制轉錄因子(如ZEB1、ZEB2、Snail、Slug和Twist等)從而促進上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程；另外，TGF-β1還能刺激腫瘤細胞產生金屬蛋白酶和ECM成分，進一步促進腫瘤細胞的侵襲性和侵襲后腫瘤微環境的重建[4]。這與CD8+CD25+FoxP3+Treg導致腫瘤分期和微侵襲狀態進展的結論相一致。然而關于Treg細胞在結直腸癌發展過程中的動力學目前尚有爭議，認為疾病早期與晚期Treg細胞變化不一致。在結腸炎相關結腸癌(colitis associated cancer,CAC)小鼠模型中，CAC早期血液和脾臟中Treg細胞顯著減少，而在腸系膜淋巴結(mesenteric lymph nodes,MLNs)的晚期檢測到Treg細胞百分比增加，且疾病早期Treg細胞的減少與預后相關[5]。但關于CD8+CD25+Treg在疾病不同時期的變化目前尚沒有相關報道。

2.1.2 惡性胸腔積液： TGF-β1和(或)IL-6可誘導CD8+CD25+Treg的產生，而在惡性胸腔積液中存在大量的IL-6和 TGF-β1，因此這種環境有利于CD8+CD25+Treg的分化。有研究[6]證實了CD8+CD25+FoxP3+Treg在肺癌外周血及其胸腔積液中表達上調，且為影響預后的獨立因素。提示在肺癌合并胸腔積液的患者中，TGF-β1和IL-6通過誘導CD8+CD25+FoxP3+Treg的形成而進一步影響了疾病的進展。

2.1.3 肝癌(hepatic cellular cancer,HCC)：既往已證實CD4+CD25+FoxP3+Treg在HCC中發揮著關鍵作用。而最近的一項研究[7]顯示，在HCC患者外周血中CD8+CD25+FoxP3+T細胞與CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞的比例均升高，且與更差的預后標志物如甲胎蛋白、肝臟局灶病變數正相關。提示CD8+CD25+FoxP3+T細胞與CD4+CD25+FoxP3+Treg一樣均可作為HCC進展的生物標志物，雖然具體的作用機制尚未明確，但針對外周擴增的CD8+CD25+FoxP3+Treg的靶向治療為肝癌的治療提供了新思路。

2.1.4 前列腺癌：在前列腺癌患者的腫瘤組織中也發現了具有很強抑制功能的CD8+CD25+Treg，通過細胞接觸依賴和可溶性因子依賴機制發揮免疫抑制作用。值得注意的是，CD8+CD25+Treg的免疫抑制能力可被TLR8信號逆轉，因此在前列腺癌的免疫治療方面，Toll樣受體8(Toll-like receptors 8，TLR8)配體可能是一個很好的選擇，通過TLR8配體操控Treg細胞功能可能有助于提高針對前列腺癌和其他惡性腫瘤疫苗的效力。

2.1.5 卵巢癌：與良性卵巢腫瘤患者和健康對照組相比，卵巢癌患者中有更高比例的CD8+Treg細胞。免疫抑制性T細胞標志物CD25、CTLA-4和Foxp3在這些細胞中表達上調，且Foxp3水平與腫瘤分期呈正相關，這表明CD8+FoxP3+Treg細胞有助于卵巢癌的進展，突出了CD8+FoxP3+Treg細胞作為卵巢癌患者臨床預后預測因子的作用[8-9]。

2.2 CD8+CD25+Treg與自身免疫性疾病

2.2.1 類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)：抗CD3 mAb能夠持續改善膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis,CIA)小鼠的關節炎，這是由于抗CD3mAb誘導了一群CD8+CD25+FoxP3+Treg以及增加了天然存在的CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例，且誘導的CD8+Treg細胞可抑制IL-17和IFN-γ的產生[10]；這在隨后的對RA患者研究中也得到了相同的結論，抗CD3mAb可誘導RA患者外周血中CD8+CD25+FoxP3+Treg形成，且通過接觸依賴的方式抑制Th17的表達進一步限制炎性反應。與此一致的是，腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)Ⅱ激動劑EHD 2-sc-MTNFR2可以提高CIA小鼠體內CD4+CD25+Treg和CD8+CD25+Treg的數量，并且血液中IL-10水平升高，從而誘導抗炎反應，緩解關節炎[11]。以上表明，CD8+CD25+FoxP3+Treg可以通過不同機制誘導抗炎性反應，針對CD8+CD25+FoxP3+Treg及細胞因子的治療策略可能成為治療各種自身免疫性疾病的新的有效方法。

2.2.2 系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)：SLE的發病可能與CD8+CD25+Treg的減少有關。在SLE患者外周血檢測到CD8+CD25+Treg較健康人明顯降低，且與腎損傷相關，并隨著病情進展其比例降低愈加明顯，但具體機制未進一步研究。在對兒童狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)伴重度蛋白尿患者靜脈注射甲基強的松龍(intravenous methylprednisolone,IVMP)脈沖治療中發現，IVMP治療恢復了CD4+CD25+FoxP3+和CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞數量，以及外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中CD8+FoxP3+Treg細胞內IL-10和顆粒酶B的更高表達，直接抑制CD4+T增殖并誘導CD4+CD45RO+凋亡，降低了PBMC對核小體主要肽自身表位的IFN-γ反應。CD8+FoxP3+Treg細胞在IVMP治療后恢復，并發揮至關重要的免疫調節作用來控制LN的自身免疫反應[12]。在降植烷誘導的狼瘡自身免疫模型中發現，CD8+Treg數量及功能降低。在SLE患者中也發現，與健康人相比，SLE患者CD8+Treg細胞中的Helios表達顯著降低，表明CD8+Treg功能下降。提示CD8+Treg數量及功能均影響著SLE疾病的發展[13]。

2.2.3 銀屑病關節炎：銀屑病關節炎是一種與銀屑病相關的炎性關節病變。目前對銀屑病關節炎與CD8+CD25+Treg細胞之間相關性的研究甚少，發現銀屑病患者外周血中CD8+CD25+Treg細胞的比例顯著下降，認為可能是抑制了IFN-γ和IL-17的分泌而促進了銀屑病進展，這為進一步研究銀屑病關節炎的免疫發病機制及其與CD8+CD25+Treg細胞之間的關系提供了線索。

2.2.4 1型糖尿病(diabetes mellitus type 1, T1DM)：T1DM是一種常見的人類自身免疫性疾病。在新發T1DM患者中發現抗CD3 mAb短期治療可使胰島β細胞功能保留至少18個月。在用人源化、改良的抗CD3 mAb治療TIDM的過程中也發現患者的胰島功能逐漸恢復，進一步的研究顯示這種變化主要與抗CD3單抗誘導的一群CD8+CD25+Tregs(CTLA-4+和FoxP3+)有關。在人源化非肥胖糖尿病(non-obese diabetes,NOD)小鼠體內檢驗到脾臟CD8+CD25+T細胞高表達Foxp3、CTLA-4、CD103，高分泌細胞因子IL-17A和INF-γ，且具有明顯的抑制能力，猜測CD8+CD25+Treg可能通過CTLA-4、CD103、IL-17和INF-γ等途徑抑制了T1DM的免疫進程，表明CD8+CD25+Treg不僅在外周同時在胰腺局部也發揮著免疫抑制作用[14]。在H6F(一種變構肽配體)處理的NODβ2mnull.HDD小鼠中分離出高表達Foxp3、CTLA-4、CD62L和CD103的CD8+CD25+Tregs，并且其抑制免疫系統的能力明顯高于從同樣小鼠中分離的CD4+CD25+Tregs，需要肽特異性再刺激來發揮其免疫抑制活性，再次說明了CD8+Treg抑制能力強于CD4+Treg[15]。這些都提示CD8+CD25+Tregs在T1DM中發揮重要作用，參與T1DM的免疫耐受進程。

2.2.5 多發性硬化癥(multiple sclerosis,MS)：CD4+CD25+FoxP3+Treg在MS免疫耐受的維持中發揮作用。隨后在急性加重期MS患者的外周血和腦脊液中也發現了較低水平的CD8+CD25+FoxP3+Treg，該細胞能夠抑制CD4+T細胞增殖及INF-γ、IL-17的分泌，且經過干預RNA消除Foxp3后可消除上述抑制作用，提示Foxp3起主要抑制作用[16]。

2.3 CD8+CD25++Treg與其他疾病

2.3.1 哮喘：TLR2激動劑可通過調節免疫反應來預防過敏和哮喘，其通過與CD8+T細胞結合可誘導CD25的持續表達，增強CD8+CD25+Treg功能并調節Th2細胞因子(降低IL-4、增加IL-10)來抑制過敏性免疫反應。在哮喘患者的臨床研究中發現，與健康人相比，哮喘患者外周血中CD8+CD25+Foxp3brighTreg的相對計數降低，與肺功能參數(FEV1、FEV1%預計值、PEF)呈正相關，決定疾病的嚴重程度，對哮喘的診斷有著相對高的特異性和敏感性。在IL-2治療哮喘患者的試驗中發現，IL-2可增加CD8+CD25+Treg高水平pSTAT-5表達細胞的比例，同時降低低水平pSTAT-5表達細胞的比例，表明個體循環CD8+CD25+Tregs內IL-2介導的STAT-5磷酸化改變可能與哮喘和疾病嚴重程度相關[17]。這些數據表明，除肺功能外，CD8+CD25+FoxP3+Treg可作為一種新的生物學標志物監測哮喘，通過調控CD8+CD25+FoxP3+Treg可以預防哮喘發作及改善肺功能。

2.3.2 過敏性疾病：Pam3CSK4(一種合成的TLR2配體)可刺激CD8+CD25+CD137+Tregs誘導IL-10和TGF-β，并主要通過細胞接觸抑制抑制CD4+CD25+T細胞增殖，降低鼻腔NO水平，抑制過敏性炎性反應[18]。與CD4+CD25+Treg相似，CD8+CD25+Treg在過敏性鼻炎患者外周血中百分比降低，但其培養物IL-10和TGF-β及其mRNA增加；檢測到CD4+CD25+Treg和CD8+CD25+Treg處理后的培養物中IL-4和IL-5含量均降低，且沒有差異，表明CD8+Tregs與CD4+Tregs一樣均可減輕過敏性鼻炎的炎性反應[19]。

2.3.3 子癇前期(preeclampsia,PE)：目前對PE的發病機制尚未有統一定論。PE患者外周血內皮細胞微粒(endothelial microparticles,EMPs)水平較正常孕婦明顯升高，且與CD8+CD25+FoxP3+Treg細胞及Foxp3mRNA表達水平呈負相關，TGF-β、IL-6、IL-17水平均升高，推測可能是EMPs通過降低Foxp3的表達而降低CD8+CD25+FoxP3+Treg比例，從而參與PE的發病機制[20]。TGF-β能誘使CD8+T細胞向CD8+Treg細胞分化，但在IL-6和TGF-β同時存在時則可分化為Tc17。這就解釋了PE患者在TGF-β大量存在的情況下CD8+CD25+FoxP3+Treg比例仍降低、而IL-17水平升高的原因。另外，PE患者CD8+CD25+FoxP3+Treg比例與血清IL-33正相關，且IL-33可誘導體外CD8+CD25+FoxP3+Treg的增殖，但在體內是否有相同的效應還需進一步的研究。以上表明CD8+CD25+FoxP3+Treg在PE的發病機制中起一定作用，為臨床診療提供了新思路。

2.3.4 2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)：T2DM是一種以胰島素抵抗和胰島素分泌受損為特征的慢性代謝性疾病。動物實驗表明，Tregs數量減少或某些功能缺陷可加速糖尿病進程，而將Tregs移植到小鼠體內可逆轉小鼠的糖代謝異常。在T2DM患者的外周血中也發現CD8+CD25+Treg比例降低，胰島素抵抗指數增加，同時細胞因子TNF-α和IL-8濃度升高[21]。CD8+CD25+Treg減少對單核細胞或巨噬細胞免疫抑制作用減弱，分泌更多的細胞因子如TNF-α和IL-8等引起炎性反應，進一步導致糖尿病及其并發癥的發生。因此，通過擴大T2DM患者外周血CD8+Treg比例可能延緩糖尿病及其并發癥的發生發展。

3 問題與展望

與CD4+Treg相比，CD8+Treg在抑制CD4+CD25-T細胞增殖和Th1細胞因子產生方面能力更強，且CD8+CD25+Treg的抑制能力也明顯強于傳統的CD8+CD25+Treg。到目前為止，在惡性疾病、自身免疫性疾病及其他常見病的發病機制中都發現CD8+CD25+Treg細胞具有免疫抑制作用，CD8+CD25+Treg在自身免疫性疾病中數量減少或功能受損，但在惡性腫瘤晚期比例升高，并且通過不同的機制來發揮免疫抑制作用。在RA中，CD8+CD25+Treg通過細胞接觸依賴、分泌細胞因子、抑制IL-17及INF-γ的產生發揮抑制效應；在銀屑病及多發性硬化癥中通過抑制IL-17及INF-γ的分泌來控制疾病進展；在T1DM中通過CTLA-4、CD103、IL-17、INF-γ等途徑及肽特異性刺激抑制了T1DM的免疫進程；而在大腸癌及肺癌合并惡性胸腔積液中CD8+CD25+Treg通過分泌TGF-β抑制免疫反應，在前列腺癌中通過細胞接觸及可溶性因子依賴發揮抑制作用。通過分析CD8+CD25+Treg在不同疾病中的發病機制，對理解不同疾病的免疫抑制及相應的治療策略有重要意義。因此針對CD8+CD25+Treg的開發及研究成為近幾年的熱點。

CD8+CD25+Treg具有強大的免疫抑制作用，它的增高對自身免疫性疾病有益，卻會因為增高過度抑制免疫而增加腫瘤發生的風險。這使人們不得不考慮以下幾個方面：一方面，監測和/或檢測CD8+CD25+Treg變得越來越重要。雖然已經鑒定了許多與Treg細胞相關的標志物，包括CD25、GITR、CTLA-4、CD122和CD103等，但到目前為止，尚無明確的特異性表面標志物能夠區分CD8+調節性T和非調節性CD8+T細胞。目前普遍認為，Foxp3是其較為特異的標志物之一，沉默Foxp3可消除CD8+Treg抑制抗DNA抗體的能力，但Foxp3在CD4+Treg中也表達，這使得CD4+Treg與CD8+Treg不好區分；也有研究表明，除了Foxp3表達之外，FoxP3+Tregs上缺乏IL-7受體(CD127)的表達是定量Tregs的方法；在抑制B細胞增殖和免疫球蛋白產生方面，CD183+CD25highCD278+CD8+Treg比CD183+CD197+CD45RA-CD8 Treg更強大，因此也可能作為CD8+Treg的首選標志物[22]，但單一的特異性標志物目前仍在研究當中；另一方面，CD8+Treg在外周血中的比例少之又少，CD8+Treg分別約占健康人和小鼠外周血T細胞的0.4%和0.1%。與CD4+Treg占外周CD4+T細胞5%～10%相比，CD8+調節性T細胞數量不及CD4+調節性T細胞的 1/10，這使得研究該細胞更加困難[23]；最后，由于其強大的免疫抑制特性，CD8+CD25+Treg作為靶向免疫治療的重要性和實用性也變得越來越突出。目前，許多研究正在探索在不同疾病環境下過繼性Treg療法的潛力，人類Treg基因組編輯方案也在逐步研究出來[24]，因此針對Treg細胞發育和存活的藥物、通過分離并擴增Treg的方法以及控制其調節特性的分子可能成為新的治療途徑。