兩種連接臂的mPEG-羥基喜樹堿納米粒的性能研究

韓露 葛小玲 宋坤 楊祚輝 周倩 袁澤軒 眭維恕 袁華兵 易曉芳

〔摘要〕 目的 設計兩種連接臂的聚合物納米粒，研究其自組裝性能及酸度調控下的緩釋性，為腫瘤組織外酸度調控下的藥物定位釋放提供研究基礎。方法 使用丁二酸酐（succinic anhydride， SA）、烏頭酸酐（cis-aconitic anhydride， CA）作為連接臂，將10-羥基喜樹堿（10-hydroxycamptothecin， 10-HCPT）與聚乙二醇單甲醚（methoxypolyethylene glycols， mPEG）連接，形成mPEG-SA-HCPT（PSH）、mPEG-CA-HCPT（PCH）聚合物。透析法制備納米粒，核磁共振氫譜、動態光散射、透射電鏡、紫外光譜對納米材料進行性能研究及其體外釋放性能測定。結果 核磁共振氫譜結果表明，聚合物成功合成。動態光散射測定PCH納米粒徑約為84.27 nm，負載HCPT后約為90.67 nm，PSH納米粒徑約為94.42 nm，負載HCPT后粒徑約為110.8 nm，透射電鏡顯示納米粒形態為均勻的圓形。紫外光譜測定載藥的PSH納米粒載藥量約為22.1%，載藥的PCH納米粒的載藥量約為25.8%。載藥后的PSH納米粒具有明顯緩釋性，48 h藥物釋放量達53.26%，pH值為6.8的釋放介質下，藥物釋放明顯加快，48 h藥物釋放量達到85.53%。而載藥的酸敏感性的納米粒子在48 h藥物釋放率為46.73%，在pH為6.8的條件下48 h釋放率為95.77%。結論 兩親性聚合物可以自組裝形成圓形納米粒，通過化學連接和物理包埋兩種手段可以得到高負載藥物量的納米粒。聚合納米材料中的酸敏感連接臂能調控聚合物納米粒的緩釋性。

〔關鍵詞〕 10-羥基喜樹堿;動態光散射;烏頭酸酐;核磁共振氫譜;透射電鏡

〔中圖分類號〕R28 ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.008

〔Abstract〕 Objective To study the self-assembly properties and the slow and controlled-release properties under the control of acidity by designing two kinds of polymer nanoparticles with connecting arms， in order to provide a research basis for drug localization and release under the regulation of acidity outside tumor tissue. Methods Succinic anhydride （SA） and aconitic anhydride （CA） was used as connecting arms， 10-hydroxycamptothecin （10-HCPT） was linked with methoxypolyethylene glycols （mPEG） to form mPEG-SA-HCPT （PSH） and mPEG-CA-HCPT （PCH） polymers. The nanoparticles were prepared by dialysis and the properties of nanomaterials were studied by nuclear magnetic resonance （NMR）， dynamic light scattering （DLS）， transmission electron microscopy （TEM）， ultraviolet （UV） spectroscopy and the property of the in vitro release was studied. Results NMR spectroscopy results showed that the polymer was synthesized successfully. The size of PCH nanoparticles was about 84.27 nm， 90.67 nm after loading HCPT， and the size of PSH nanoparticles was about 94.42 nm， 110.8 nm after loading HCPT. TEM showed that the shape of the nanoparticles was uniform and spherical. UV spectroscopy showed the drug loading capacity of PSH nanoparticles and PCH nanoparticles were about 22.1% and 25.8%， respectively. PSH nanoparticles after drug loading showed obvious sustained release， and the drug release reached 53.26% at 48 h. In the release medium of pH 6.8， the drug release was significantly accelerated， and the drug release reached 85.53% at 48 h. The drug release rate of acid sensitive nanoparticles was 46.73% at 48 h and 95.77% at pH 6.8. Conclusion Amphiphilic polymers can self assemble into spherical nanoparticles， and high drug loading nanoparticles can be obtained by chemical bonding and physical embedding. The acid sensitive arm in polymeric nanomaterials can control the slow release property of polymer nanoparticles.

〔Keywords〕 10-hydroxycamptothecin; dynamic light scattering; aconitic anhydride; nuclear magnetic resonance spectroscopy; transmission electron microscopy

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，發病率占胃腸道腫瘤的第三位[1-2]。目前，化療是臨床治療結腸癌的主要手段，喜樹堿（camptothecin， CPT）是常用的抗消化道腫瘤的化療藥物。10-羥基喜樹堿（10-hydroxycamptothecin， 10-HCPT）為S期特異性的抗腫瘤藥物，拓撲異構酶I為CPT的主要作用部位，在體外和體內都能顯著抑制人結腸細胞系的生長[3]。然而，同許多小分子抗癌藥物一樣，10-HCPT的水溶性很差，導致其生物利用度低;靶向性差，導致其產生不良反應。若能將10-HCPT制成一種制劑，提高其水溶性，并使其靶向到腫瘤組織，便能有效改善10-HCPT臨床治療的效力[4]。

納米靶向制劑是目前癌癥治療的一種新型手段，利用納米膠束特定的尺寸能使其高效到達靶組織，實現藥物在靶組織的富集[5-6]。納米粒子對腫瘤組織的靶向是靠其特定的尺寸實現的，由于腫瘤組織血流供應豐富，存在著特殊的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention effect， EPR），粒徑在100 nm左右的納米粒子可以通過EPR效應透過腫瘤組織處的血管內皮，實現其在腫瘤組織處的被動靶向[7-9]。使用納米粒子作為藥物載體時，可以使用接枝、包埋等方法將疏水藥物負載于疏水核心里，可以極大地提高藥物的溶解度，改善其生物利用度。未經修飾納米膠束在循環系統被血漿中的調理素、整合素等吸附，使其易于被吞噬細胞識別，進而被單核吞噬細胞系統及網狀內皮系統吞噬，降低了藥物的生物利用率[10]。聚乙二醇單甲醚（methoxypolyethylene glycols， mPEG）是一種用途極為廣泛的高分子化合物，具有優異的生物相容性[11-12]。研究表明，用mPEG修飾納米膠束表面時，納米膠束表面形成一層水化膜，使其難以被調理素、整合素吸附，從而避免了血液中的單核細胞和巨噬細胞的吞噬，使其在血液中的駐留時間延長，達到長循環的效果[13-14]。

但是，mPEG在保護納米膠束的同時，也減少了腫瘤細胞對納米膠束的吞噬[15]。因此，如果讓納米膠束被動靶向至腫瘤組織處后，可以在細胞外定位釋放，就能提高抗癌藥物在細胞局部的濃聚，從而提高治療效力。由于大多數腫瘤細胞會通過糖酵解方式生成ATP，腫瘤細胞微環境積聚大量乳酸，細胞外環境呈弱酸性[16-17]。有報道表明，選用烏頭酸酐（cis-aconitic anhydride， CA）作為酸敏感連接臂[18]，雙鍵共軛酸生成的酯在酸性條件容易水解。因此，本研究用CA作為連接臂將mPEG與10-HCPT接枝，形成兩親性聚合物，同時采用常用的普通連接臂丁二酸酐（succinic anhydride， SA）作為對比研究。兩親性聚合物在水溶液中可以自組裝成為親水基殼，疏水基為核的殼-核結構納米粒。疏水核心可以通過疏水作用力負載疏水藥物，形成負載藥物的納米粒。傳統聚合物納米膠束多采用高分子親水性聚合物作為基本骨架，導致載藥量低下。得到一種結構簡單、載藥量高的納米膠束是解決納米膠束藥物臨床應用的關鍵點。

針對傳統納米粒子的載藥率低、結構復雜等問題，本研究設計了一種新型的酸敏感連接臂載藥mPEG-CA-HCPT（PCH）納米粒和普通連接臂的mPEG-SA-HCPT（PSH），其結構簡單、具有化學連接10-HCPT和物理包埋10-HCPT雙載藥特性。由于結腸癌組織的EPR效應，通過雙載藥物納米粒的小尺寸效應，被動靶向腫瘤組織，以提高治療效力。

1 材料和方法

1.1 ?材料

10-HCPT（上海能源化學有限公司，批號：19685-09-7，純度99%）;1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride， EDCI]（批號：7084-11-9，純度98%）、4-二甲基氨基哌啶（4-dimethylaminopyridine， DMAP）（批號：1122-58-3，純度99%）均購自上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 ?儀器

紫外分光光度計（型號：VF 3001）、透射電子顯微鏡（型號：JEM-100C）均購自美國賽默飛世爾科技公司;動態光散射儀（英國馬爾文儀器有限公司，型號：ZS-90）;核磁共振氫譜儀（德國布魯克科技有限公司，型號：AVANCE-Ⅲ500）。

1.3 ?聚合物的合成及表征

1.3.1 ?mPEG-CA的合成 ?取2 g mPEG（2000 Da）、0.15 g CA、0.18 g DMAP、0.28 g EDC-HCl溶于20 mL二氯甲烷，將圓底燒瓶置于磁力恒溫攪拌器上，50 ℃恒溫條件下，反應48 h。將反應液移入旋轉蒸發儀中，處理過后收集固體并加水溶解，使用纖維素透析袋（截留量1000 kDa）透析24 h，凍干即得mPEG-CA。

1.3.2 ?PCH的合成 ?取0.34 g mPEG-CA、0.025 g DMAP、0.023 g NHS在10 mL N，N-二甲基甲酰胺常溫下充分反應。加入50 mg HCPT，向燒杯中通入氮氣，常溫下避光反應48 h。將反應液邊攪拌緩緩倒入100 mL乙醚/乙酸乙酯（1∶1）溶液中，抽濾，洗滌，得到固體，將固體移入圓底燒瓶。加入150 mL DCM，攪拌至溶解，用30 mL（pH=7.4）NaHCO3溶液洗滌兩次。加入適量無水Na2SO4，靜置2 h，過濾至濾液澄清透明，再用旋轉蒸發儀處理濾液，收集固體，如圖1所示。抽濾，無水乙醚洗滌，干燥后儲存。

1.3.3 ?核磁共振氫譜 ?取少量PEG、HCPT、PSH和PCH固體，溶于適量氘代DMSO中。將溶液移至試樣管中，至液層高35～40 mm，加入TMS等基準物質，進行核磁共振氫譜測定。

1.4 ?載藥PSH納米粒的制備

將PSH聚合物2.5 mg加入圓底燒瓶，加入2 mL DMSO，恰好完全溶解，室溫下攪拌5 min。然后將溶液緩慢滴入5 mL PBS（pH=7.4）中，室溫下輕攪30 min。將溶液以16 000 r/min的轉速離心10 min（離心半徑6 cm），用PBS洗滌后再次以16 000 r/min的轉速離心10 min（離心半徑6 cm）。最后用PBS將溶液定容至0.5 mg/mL，4 ℃下冷藏備用。取10 mg的PSH聚合物，1 mg的HCPT，溶于適量的DMSO中，待完全溶解后轉入透析袋，避光透析，每次加500 mL蒸餾水，前3 h每1 h換水1次，后6 h每2 h換水1次，將DMSO透析干凈，自組裝制備載藥納米粒，備用。

1.5 ?載藥PCH納米粒的制備

參照“1.4”方法取10 mg的PCH聚合物、1 mg的HCPT，自組裝制備載藥納米粒，備用。

1.6 ?納米粒子的表征

1.6.1 ?動態光散射 ?取已制備的納米粒樣品2 mL，分別用0.45 μm微孔濾膜過濾，然后用動態光散射儀測定納米粒子樣品的尺寸和電位。

1.6.2 ?載藥量的測定 ?配置一系列不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）的HCPT溶液，將溶液依次移入比色皿，測定在265 nm處的吸光度。再分別取適量制備的3種載藥納米膠束（均已定容至0.5 mg/mL）移入比色皿，測定在265 nm處的吸光度。按下列公式計算載藥量（LC）：

LC=納米粒子中的藥物量/納米粒子重量×100%（1） ? ? ? ? ? ? ?1.7 ?體外藥物釋放量測定

取載藥納米粒子和納米粒子，每份2 mL，裝入透析袋（截留分子量為3500 Da），再將透析袋分別放入50 mL不同pH值（pH=7.4和pH=6.8）的PBS緩沖液中，在37 ℃、100 r/min的條件下避光振蕩透析。在預定時間點Tn=0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96 h取樣，收集2 mL釋放介質，并補充加入等體積的PBS緩沖液。然后用紫外分光光度計測量溶液的吸光度以測定釋放的藥物濃度。游離藥物的釋放作為對照，計算藥物釋放百分率（Q），如下列公式：

Q=（Cn×V+VCi）/（Wnp×LC%）（2）

其中W是納米粒子的重量，Cn是在Tn時的樣品濃度，V是釋放介質的總體積;Vn是樣品量（2 mL）;Ci是Ti處的樣品濃度（i=0，0.5，1，…，n，V0和C0均等于0）

2 結果

2.1 ?核磁分析

mPEG的特征峰（3.0～4.0 mg/L）和HCPT的特征峰（4.0～8.5 mg/L）相應在PSH、PCH中出現，表明二者合成成功。見圖2-3。

2.2 ?納米粒子的表征

PCH納米粒子的粒徑大約84.27 nm，分散度系數（polydispersity index， PDI）值為0.286，納米粒表面電動電位（Zeta電位）為-0.131 mV，載藥PCH納米粒子的粒徑大約90.67 nm，PDI值為0.222，Zeta電位為-0.301 mV，兩種納米粒子透視電鏡下都呈圓形，分散度好。PSH納米粒子的粒徑大約94.42 nm，PDI值為0.219，Zeta電位為-9.37 mV，載藥PSH納米粒子的粒徑大約110.8 nm，PDI值為0.267，Zeta電位為-8.75 mV，電鏡下呈圓形。見圖4-5。

2.3 ?不同性能的納米粒藥物負載的效率

PSH納米粒的載藥量約為15.3%，而載藥后PSH納米粒載藥量約為22.1%。本實驗設計的納米粒既包含化學連接藥物，也有通過物理包埋的方式，化學連接負載的載藥量15.3%，物理包埋的載藥量為6.8%，負載藥物的總體量相對較高。PCH的載藥量約為18.4%，而負載HCPT的羥基喜樹堿的載藥量約為25.8%，因此，通過物理包埋的藥物載藥量約為7.4%。PCH無論是物理包埋還是接枝的藥物量均高于PSH納米粒，可能是由于順式烏頭酸上更多的羧基所造成的，更多的羧基可以接更多的藥物。

2.4 ?納米粒的藥物釋放

游離藥物在8 h內快速釋放率達94.32%，載藥PSH納米粒的藥物釋放呈現逐步釋放特性，開始12 h內釋放較快，后一階段釋放速度減緩，48 h藥物釋放率達到53.26%。在釋放介質pH值為6.8時，載藥PSH納米粒釋放明顯變快，48 h藥物釋放率達85.53%。PSH納米粒在釋放介質pH值為7.4時，釋放非常緩慢，在前8 h藥物釋放率很少，48 h藥物釋放率僅4.95%，在釋放介質pH值為6.8時，藥物釋放顯著加快，48 h藥物釋放率約為72.15%，藥物釋放呈現pH依耐性。見圖6。

在生理條件下，PCH納米粒子的48 h釋放率為4.32%，而載藥PCH納米粒子的48 h釋放率46.73%。在pH=6.8的條件下，PCH納米粒子的48 h釋放率為89.52%，而載藥PCH納米粒子的48 h釋放率為95.77%。在正常生理條件時，酸敏感性納米粒子的釋放相比非酸敏感的較低，可能是由于藥物顯堿性，而CA顯酸性，二者靜電作用力較強;而在低pH時，酸敏感鍵斷裂使藥物更快釋放。見圖7。

3 討論

10-HCPT是疏水性藥物，通過酸敏感連接臂將其與親水性聚合物mPEG連接形成兩親性聚合物，在水溶液自組裝過程中，可以通過疏水作用力、分子間作用力、氫鍵等弱作用力包埋10-HCPT，形成載藥納米粒。通過物理包埋和化學連接兩種方式負載藥物，具有比較高的藥物負載效率。由于物理包埋是弱作用力，所以藥物比較容易釋放。其中，通過分子作用力吸附在納米粒表面的藥物釋放最快，呈現一個快速的釋放過程，后面呈現藥物的緩慢釋放，主要表現為通過疏水作用力包埋到納米粒疏水中心的藥物釋放。本研究是通過酸敏感連接臂形成的聚合物納米粒，在弱酸性環境中藥物的釋放呈現控制釋放，藥物釋放除了表現為弱作用力包埋的藥物的釋放外，還表現為化學共價鍵連接的藥物釋放。對于聚合物納米粒而言，化學共價鍵連接的藥物釋放，會導致納米粒解聚，進而會促進物理包埋的藥物爆發性釋放，釋放加快，釋放量增加。

表面含有mPEG的聚合物納米粒可以避免肝的網狀內皮系統的吞噬，減少在肝的沉積，從而降低藥物對肝的毒性[19]。由于EPR效應，納米粒可以高效地通過被動靶向腫瘤組織。納米粒在腫瘤組織發揮治療作用主要可能通過兩個方式：（1）納米粒在腫瘤細胞外釋放，藥物以游離方式擴散進入癌細胞發揮作用;（2）納米粒被腫瘤細胞吞噬，藥物在溶酶體內釋放發揮藥理作用[20]。由于腫瘤組織外呈現弱酸性環境，本研究設計的聚合物納米粒，具有酸敏感的藥物釋放，推測藥物在體內發揮抗腫癌療效主要是細胞外藥物的定位釋放。

本項目通過化學連接和物理包埋兩種方式提高藥物的負載效率，采用的載體材料mPEG是體內可以應用的生物醫用材料。通過mPEG修飾旨在使納米粒在肝組織沉積減少，通過EPR效應增強腫瘤組織的被動靶向作用[21]。通過酸敏感的連接臂形成的聚合物納米粒，具有酸調控的緩慢釋放，從而發揮腫瘤組織的定位釋放，提高納米藥物的抗癌效力[22]。本研究通過一種簡單方法制備了一種新型的納米粒，初步考察了其體外性質及載藥功能，為進一步進行體內功能研究提供了基礎。

參考文獻

[1] 宋 ?琳，張 ?利，蔣益蘭.健脾消癌方對缺氧微環境誘導的結腸癌細胞生物學行為影響及抑癌機制研究[J].湖南中醫藥大學學報，2021，41（2）：211-217.

[2] 彭 ?俊，呂慧婕，丁星星，等.MicroRNA在結腸癌診斷及中醫藥防治的研究進展[J].醫學理論與實踐，2021，34（21）：3713-3714，3718.

[3] 范子琪，徐 ?勤，秦金保，等.羥基喜樹堿藥物遞送系統抗腫瘤研究進展[J].醫學綜述，2021，27（9）：1796-1801.

[4] 楊若瀾，郭 ?惠，靳如意，等.喜樹堿結構修飾及抗腫瘤靶向性研究進展[J].中國藥物化學雜志，2020，30（11）：696-704.

[5] KANAPATHIPILLAI M， BROCK A， INGBER D E. Nanoparticle targeting of anti-cancer drugs that alter intracellular signaling or influence the tumor microenvironment[J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2014， 79/80： 107-118.

[6] AKHTER S， AHMAD Z， SINGH A， et al. Cancer targetedmetallic nanoparticle： Targeting overview， recent advancement and toxicity concern[J]. Current Pharmaceutical Design， 2011， 17（18）： 1834-1850.

[7] 高春曉，魏訓東，黃 ?衛，等.納米藥物對腫瘤免疫微環境的影響[J]. 中國藥學雜志，2021，56（19）：1546-1550.

[8] 潘 ?超，王曉峰.殼聚糖納米粒子在藥物遞送系統中的應用進展[J]. 實用臨床醫藥雜志，2021，25（4）：116-120.

[9] 周世月，邵瑩瑩，李 ?媛，等.中藥有效成分納米制劑抗腫瘤的研究進展[J].天津中醫藥大學學報，2020，39（4）：374-380.

[10] 韓文釗.內源性環境響應型自組裝肽聚合物納米載藥系統的構建及抗腫瘤活性研究[D].長春：吉林大學，2021.

[11] 孫冰冰，趙紅玲，李瑩瑩，等.葉酸與端醛基聚乙二醇雙重修飾的殼聚糖-硬脂酸納米膠束的制備[J].中國藥房，2019，30（21）：2926-2931.

[12] 劉 ?源，周建平，王 ?偉.聚乙二醇修飾靶向納米制劑的研究進展[J].中國藥科大學學報，2017，48（3）：268-275.

[13] 秦 ?歡，張 ?兵，馬 ?喆，等.PEG修飾的紫草素納米結構脂質載體的制備和體外評價[J].天津中醫藥大學學報，2021，40（5）：647-652.

[14] MASOOD N， AHMED R， TARIQ M， et al. Silver nanoparticle impregnated chitosan-PEG hydrogel enhances wound healing in diabetes induced rabbits[J]. International Journal of Pharmaceutics， 2019， 559： 23-36.

[15] 郝若祎，耿 ?雪，徐世一，等.As2O3-PLA-NPs、As2O3-mPEG-PLA-NPs對腫瘤細胞MCF-7/ADR增殖和凋亡的影響[J].中醫藥信息，2021，38（3）：8-15.

[16] 林舒婷，朱丹丹，韓麗麗，等.基于聚酰胺-胺型樹形分子的腫瘤微環境刺激響應性遞藥系統的研究進展[J].中國醫藥工業雜志，2021，52（6）：757-770.

[17] LAPLANE L， DULUC D， BIKFALVI A， et al. Beyond the tumour microenvironment[J]. International Journal of Cancer， 2019， 145（10）： 2611-2618.

[18] 孫瑞陽.人參皂苷Rg3和順式烏頭酸酐-阿霉素共載藥膠束的制備與評價[D].大連：遼寧師范大學，2019.

[19] SMOLAR M， MIKOLAJCIK A， DEDINSKA I， et al. Liver abscess as a rare complication of PEG[J]. Perspectives in Surgery， 2019， 98（5）： 219-222.

[20] 楊惠卿，王 ?喻，駱紅飛，等.載紫杉醇的pH敏感型熱休克蛋白納米載體的腫瘤細胞攝取特性及藥理學評估[J].廈門大學學報（自然科學版），2019，58（6）：811-816.

[21] 李 ?昕，朱丹丹，陳 ?裕，等.納米藥物遞送系統在促進腫瘤深層滲透方面的研究進展[J].中南藥學，2020，18（12）：2009-2018.

[22] 陳 ?曦，祝星宇，馬博樂，等.基于腫瘤微環境的納米靶向載體研究進展[J].中國藥房，2017，28（13）：1864-1869.